补肾软坚方药从调控脂联素表达异常干预动脉粥样硬化和脂肪肝的机制研究
冠心病是我国成年人住院和死亡的主要原因，其病理基础是动脉粥样硬化。目前研究认为，脂肪肝不仅是动脉粥样硬化发病的独立危险因子，还是不依赖于心血管疾病传统危险因素的独立预测因素，其对心血管疾病的作用可能独立于肥胖和代谢综合征，已成为当前动脉粥样硬化发病的重要原因。本团队前期研究表明，补肾软坚方药不仅能通过调脂、抗炎、抗氧化应激发挥抗动脉粥样硬化作用，还可通过激活iNOS/CO路径中相关节点蛋白，提高机体抑制过氧化/硝基化能力，达到抑制炎症反应、延缓动脉粥样硬化发生发展的作用。但补肾软坚方药是否具有减轻肝脂肪变性的作用？是否具有调节APN及其受体表达发挥抑制炎症反应抗动脉粥样硬化的作用？还有待于进一步实验证实。
目前，研究动脉粥样硬化的造模方法主要有免疫损伤加高脂饲料喂养法、注射同型半胱氨酸或儿茶酚胺类药物法及基因敲除复合高脂饲料喂养法等。其中，较经典的是高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠法，该方法操作简便，易于成模，可重复性强，且国内外均有文献将其用于动脉粥样硬化和脂肪肝的相关实验研究。本实验拟采用高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠复制动脉粥样硬化模型，探讨补肾软坚方药调控APN及其受体表达影响动脉粥样硬化和脂肪肝病理进程的机制。
（一）材料与方法
1.动物 雄性C57BL/6J小鼠、雄性SPF级ApoE-/-小鼠。
2.主要试剂和药品 辛伐他汀片，补肾软坚方药，多聚赖氨酸，SP试剂盒，DAB显色试剂盒，苏木素-伊红（HE）染色试剂盒，小鼠脂联素（APN）ELISA试剂盒，小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒，小鼠白介素10（IL-10）ELISA试剂盒，小鼠单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）ELISA试剂盒，小鼠血管内皮细胞黏附因子1（VCAM1）ELISA试剂盒，小鼠脂联素（APN）多克隆抗体，小鼠脂联素受体1（AdipoR1）多克隆抗体，小鼠脂联素受体2（AdipoR2）多克隆抗体，小鼠Toll样受体4（TLR4）多克隆抗体，小鼠核转录因子kappa B（NF-κB）多克隆抗体，小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）多克隆抗体，超纯RNA提取试剂盒，DNaseⅠ（RNase-free），UltraSYBR Mixture（with Rox），HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒。
3.方法
（1）实验分组及给药 雄性SPF级C57BL/6J小鼠16只和雄性SPF级ApoE-/-小鼠32只。适应性喂养1周后，C57BL/6J小鼠给予普通饲料，为对照组（n=16）；ApoE-/-小鼠给予高脂饲料（含脂肪21%，胆固醇0.15%，碳水化合物50%，蛋白质20%），为模型组（n=32）。喂养4周后，每组随机抽取8只小鼠，观察小鼠一般形态，并行肝脏和主动脉病理染色及血脂生化检测。剩余模型组小鼠再随机分为模型组（n=8，等体积蒸馏水，灌胃）、辛伐他汀组（n=8，5.28mg/kg/d，灌胃）、补肾软坚方药组（以下简称补肾软坚组。n=8，1.19g/kg/d，灌胃）。在第4周开始给药，各组小鼠每天在固定时间给药1次，给药量为0.8mL。
（2）取材 分别于第4周、第16周取材，观察肝脏一般形态，称取肝脏质量，计算肝指数，行肝脏和主动脉HE染色，计算斑块狭窄程度。
（3）主动脉和肝脏组织苏木素-伊红（HE）染色 将组织石蜡切片制备后，进行HE染色。用Image-Pro Plus 6.0型图像分析软件测量主动脉所看到的每一块斑块及管腔面积，计算血管管腔狭窄程度[管腔狭窄程度=（板块面积/血管管腔面积）×100%]。
（4）免疫组化测定主动脉和肝脏组织APN、AdipoR1、AdipoR2及TLR4/NF-κB信号通路的表达 将肝脏和主动脉瓣组织制作固定包埋后制作石蜡切片，使用DAB显色、苏木素复染细胞核，用显微镜观察，选择有意义的组织相，经登录、编号、采集、分析、读取数据，最终存盘。
（5）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测主动脉和肝脏组织TLR4、NF-κB mRNA的表达 提取主动脉和肝脏组织总RNA，检验总RNA纯度和浓度，取5μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用反转录试剂盒中的gDNA Eraser（TaKaRa code DRRO47A）对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理。RNA消化、反转录合成cDNA，实时荧光定量PCR、ELISA测定小鼠血清APN含量，ELISA测定小鼠血清APN含量、IL-10含量、MCP-1含量、VCAM-1含量。
4.统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件，数据以均值±标准差（x±s）表示，两组间数据比较采用t检验（t-test），多组间比较采用单因素方差分析（One way ANOVA）。首先对数据进行方差齐性检验，方差齐则用LSD法，方差不齐则用Dunnet’s T3法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
（二）结果
1.补肾软坚方药对小鼠主动脉病变的影响
（1）补肾软坚方药对小鼠主动脉组织病理结构的影响 在第4周时（见附录，图3-43），对照组和模型组主动脉组织血管内膜尚完整，未见泡沫细胞、脂质核心及斑块形成。在第16周时（见附录，图3-44），对照组小鼠主动脉内皮结构完整，未见泡沫细胞、脂质核心及斑块形成。模型组主动脉管壁可见大量脂质斑块，融合成片，管腔明显狭窄；斑块内可见大量脂质浸润、泡沫细胞形成，纤维帽变薄。辛伐他汀组和补肾软坚组主动脉亦可见到融合成片的动脉粥样硬化斑块，然其病变较模型组减轻，泡沫细胞数量相对较少；斑块纤维帽较厚。
（2）补肾软坚方药对小鼠主动脉管腔狭窄程度的影响 与对照组相比，模型组小鼠主动脉管腔变窄（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组小鼠的管腔狭窄程度减轻（P＜0.05）。两用药组比较，差异不显著（P＞0.05）。（见附录，图3-45）
（3）补肾软坚方药对小鼠血清脂联素表达水平的影响 初步研究认为，低APN血症不仅是NAFLD的重要特征，也是导致AS的独立危险因子。本研究证实了这一结论。与对照组相比，模型组小鼠血清APN表达水平明显降低，差异显著（P＜0.05）；辛伐他汀能够逆转这一趋势，上调小鼠血清APN表达水平（P＜0.05）；而补肾软坚组显示与辛伐他汀组相同的作用（P＞0.05）。（见附录，图3-46）
（4）补肾软坚方药对主动脉组织脂联素及其受体表达的影响 主动脉组APN及其受体免疫组化染色结果显示：APN、AdipoR1和AdipoR2均在血管内皮细胞及平滑肌细胞等细胞膜及胞质中呈棕褐色颗粒表达。与对照组比较，模型组APN和AdipoR1的表达降低（P＜0.05）。与模型组比较，辛伐他汀组的APN和AdipoR1的表达水平升高（P＜0.05）；与辛伐他汀组比较，补肾软坚方药在此方面具有相同的作用（P＞0.05）。而AdipoR2的蛋白表达水平在高脂饲料及药物干预前后却未见明显变化（P＞0.05）。（见附录，图3-47）
（5）补肾软坚方药对主动脉组织TLR4、NF-κB mRNA及相关蛋白表达的影响
①补肾软坚方药对主动脉组织TLR4、NF-κB mRNA表达的影响：与对照组相比，模型组小鼠主动脉TLR4和NF-κB的mRNA表达水平明显增高（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀能够抑制TLR4和NF-κB的mRNA表达（P＜0.05）。与辛伐他汀组比较，补肾软坚方药下调TLR4和NF-κB的mRNA表达的作用更为显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（见附录，图3-48、图3-49、图3-50）
②补肾软坚方药对主动脉组织TLR4/NF-κB通路蛋白表达的影响：免疫组化结果显示TLR4、TNF-α主要在血管内皮及平滑肌等细胞胞质呈棕褐色颗粒表达，NF-κB主要在血管内皮、平滑肌等细胞胞质及细胞核内呈棕褐色颗粒表达。随着TLR4和NF-κB的mRNA表达水平升高，模型组TLR4/NF-κB通路被激活，TLR4、NF-κB和TNF-α蛋白呈高表达，差异具有显著性（P＜0.05）。与模型组比较，辛伐他汀组TLR4、NF-κB和TNF-α的蛋白表达被抑制（P＜0.05）。而补肾软坚方药显示出与辛伐他汀相同的作用，差异不显著（P＞0.05），这可能与基因的表达受环境等因素的作用有关。（见附录，图3-51）
2.补肾软坚方药对小鼠肝脏病变的影响
（1）小鼠肝脏一般形态的观察 在第4周时（见附录，图3-52），对照组小鼠肝脏呈红褐色，边缘光滑锐利，未见异常变化；肝脏周围未见脂肪堆积。模型组小鼠肝脏呈棕黄色，触之稍有油腻感，肝脏周围可见脂肪堆积。在第16周时（见附录，图3-53），模型组小鼠肝脏呈土黄色，体积明显增大，触之有油腻感，肝脏周围可见大量白色脂肪堆积。辛伐他汀组小鼠肝脏呈淡红色，体积增大，触之有油腻感，肝脏周围可见大量白色脂肪堆积。补肾软坚组小鼠肝脏呈淡红色，体积稍大，触之有油腻感，肝脏周围可见白色脂肪堆积。而对照组小鼠肝脏呈红褐色，边缘光滑锐利，无异常变化；肝脏周围未见脂肪堆积。
（2）补肾软坚方药对小鼠肝指数的影响 与对照组相比，模型组小鼠的肝指数升高，差异具有显著性（P＜0.05），提示模型组小鼠肝脏已经发生脂肪变。与模型组相比，辛伐他汀可以降低小鼠的肝指数（P＜0.05）。补肾软坚组与辛伐他汀组比较，差异不显著（P＞0.05）。（见附录，图3-54）
（3）补肾软坚方药对小鼠肝脏组织病理结构的影响 在第4周时，对照组小鼠肝小叶基本结构存在，小叶界板清晰，未见炎症细胞增多，未见肝脂肪变及纤维化。模型组小鼠肝组织以小泡性肝细胞脂肪变为主，肝细胞质中有脂滴存在；肝小叶内可见分叶核、杆状核及单个核细胞浸润，局部可见花环状肝细胞。在第16周时（见附录，图3-55），对照组小鼠肝组织基本结构存在，肝小叶可见，边界尚清。肝细胞内有少量脂滴形成，偶见少量炎症细胞。模型组小鼠肝组织以大泡性脂肪变为主，甚至有大的脂滴空泡将肝细胞核挤压至一边。肝小叶伴大量炎症细胞浸润，甚至点状或灶状坏死。辛伐他汀组小鼠肝组织仍可见到大泡性脂肪变，胞质中可见脂滴空泡，个别将细胞核挤压至一边，肝小叶局部可见炎症细胞浸润。补肾软坚组小鼠肝组织大泡性脂肪变较辛伐他汀组稍减轻，胞质中可见脂滴空泡，肝小叶局部可见炎症细胞浸润。
（4）补肾软坚方药对肝脏组织APN及其受体表达的影响 免疫组化结果显示，APN主要在中央静脉及肝血窦区域呈棕褐色颗粒表达，AdipoR1、AdipoR2在肝细胞膜及胞质呈棕褐色颗粒表达。与对照组比较，模型组肝脏APN的蛋白表达水平未见明显降低，差异不显著（P＞0.05）。与模型组比较，辛伐他汀组和补肾软坚组小鼠肝脏APN的蛋白表达水平进一步下降，差异具有显著性（P＜0.05）。除此以外，与对照组比较，模型组的肝脏AdipoR1和AdipoR2蛋白表达量降低（P＞0.05），提示肝脏内存在APN抵抗。与模型组比较，经药物干预后，两组小鼠肝脏AdipoR1和AdipoR2的表达水平升高（P＜0.05）。其中，补肾软坚方药上调肝脏AdipoR1表达的能力较辛伐他汀强，差异具有显著性（P＜0.05）。（见附录，图3-56）
（5）补肾软坚方药对肝脏组织TLR4 mRNA、NF-κB mRNA及相关蛋白表达的影响
①补肾软坚方药对肝脏组织TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达的影响：与对照组比较，模型组肝脏TLR4和NF-κB的mRNA表达水平明显增高，差异具有显著性（P＜0.05）；与模型组相比，补肾软坚方药和辛伐他汀均具有抑制TLR4和NF-κB的mRNA表达的作用，差异具有显著性（P＜0.05）。与辛伐他汀组比较，补肾软坚组在下调此二者表达方面具有一定的优势（P＜0.05）。（见附录，图3-57、图3-58、图3-59）
②补肾软坚方药对肝脏组织TLR4/NF-κB通路蛋白表达的影响：免疫组化结果显示TLR4、TNF-α主要在肝细胞胞质呈棕褐色颗粒表达，NF-κB主要在肝细胞胞质及细胞核内呈棕褐色颗粒表达。与对照组比较，模型组小鼠肝脏TLR4、NF-κB和TNF-α的蛋白表达水平升高，差异具有显著性（P＜0.05）；与模型组相比，补肾软坚方药和辛伐他汀能够抑制TLR4、NF-κB和TNF-α的蛋白表达，差异具有显著性（P＜0.05）。两用药组比较差异不显著（P＞0.05）。（见附录，图3-60）
3.补肾软坚方药对小鼠血清相关炎症介质表达水平的影响 与对照组比较，不仅模型组小鼠的肝脏和主动脉组织呈高炎症反应状态，其血清TNF-α、MCP-1和VCAM-1表达水平亦明显升高，而具有抗炎作用的IL-10表达水平却有所降低，差异具有显著性（P＜0.05）。与模型组比较，辛伐他汀组小鼠血清TNF-α、MCP-1和VCAM-1表达水平降低，IL-10的表达水平升高，差异具有显著性（P＜0.05）。两用药组比较，差异不显著（P＞0.05）。（见附录，图3-61）
本研究结果表明，经高脂饲料喂养后，模型组小鼠不仅呈现出显著的低APN血症，在主动脉组织和肝脏组织中APN及其受体亦呈低表达。经补肾软坚方药干预后，ApoE-/-小鼠的主动脉粥样硬化病变程度减轻。究其原因，一方面可能与补肾软坚方药升高其血清APN表达水平、减轻机体炎症反应状态有关；另一方面可能与补肾软坚方药上调主动脉和肝脏脂联素受体表达，促进APN与其受体结合，增加APN在主动脉组织的聚集利用，改善肝脏APN抵抗，进而抑制主动脉和肝脏组织TLR4/NF-κB信号通路有关。
（三）讨论
心血管疾病所致死亡占我国城乡居民总死亡原因的首位。随着人口老龄化及城镇化进程的加速，中国心血管疾病危险因素日益明显，由此导致疾病负担不断加重，已成为目前迫切需要解决的重大公共卫生问题。心血管疾病的防治已逐步由点及面地向综合防治方向发展。脂肪肝是不依赖于心血管疾病的独立预测因素，其对心血管疾病的作用可能独立于肥胖和代谢综合征，已成为当前动脉粥样硬化发病的重要原因之一。在治疗动脉粥样硬化的同时干预脂肪肝，可能有助于进一步提高动脉粥样硬化防治的效果。而目前现代医学在此方面手段单一，限制了患者临床获益。中医药具有多途径、多靶点作用，在治疗心血管疾病合病、并病中发挥着不可替代的作用，具有鲜明的特色和优势。
本实验研究结果表明，模型组小鼠主动脉TLR4/NF-κB信号通路被有效激活，肝脏组织TLR4/NF-κB信号通路也被有效激活，整个机体处于免疫炎症紊乱状态。而补肾软坚方药和辛伐他汀却能够在一定程度上抑制主动脉和肝脏组织TLR4/NF-κB信号通路的表达，并下调组织和血清中促炎因子TNF-α水平，上调血清中抗炎因子IL-10的表达。与此同时，血清中的MCP-1、VCAM-1也随着炎症反应的抑制，呈进一步下调的趋势。TNF-α是由单核-巨噬细胞分泌产生，具有多种生物学功能的炎症介质，是反映机体炎症反应状态的经典指标，其表达水平与脂肪肝和动脉粥样硬化的发生发展密切相关。TNF-α不仅能够通过破坏PPAR-LXR-CYP7A1/ABCA1介导的胆汁酸合成和胆固醇流出增加肝脏脂质聚集；还能通过加速炎症细胞脂质过氧化进程，促进血管平滑肌细胞释放IL-1、VCAM-1、ICAM-1等炎症介质，引起内皮损伤；通过打破体内凝血与抗凝系统平衡，间接促进MMPs的表达，增加ECM降解，加重动脉粥样硬化斑块的不稳定性。IL-10能够通过抑制T淋巴细胞活化，干扰NK细胞和巨噬细胞产生细胞因子，降低单核-巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达水平，抑制细胞免疫炎症应答，发挥抗炎作用。MCP-1、VCAM-1是参与细胞黏附聚集反应的关键细胞因子，能在一定程度上反应动脉粥样硬化病变的轻重。MCP-1一方面能够趋化单核细胞黏附于内皮细胞；另一方面能够促进其他炎症介质和MMPs的释放，诱导内皮细胞增生和血管平滑肌细胞增殖迁移，导致内膜增厚，斑块脂核增大，纤维帽变薄，进而加速动脉粥样硬化的发生发展。敲除MCP-1基因的ApoE-/-或LDL-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积可较对照组减少约60%。VCAM-1是早期动脉粥样硬化炎症开始的一个重要标志，它不但能够参与动脉粥样硬化形成过程中所涉及的炎症细胞浸润和迁移，促进单核细胞黏附聚集，并转化为巨噬细胞，而且还能够向淋巴细胞提供抗原，引起局部免疫炎症反应，促进B淋巴细胞和T淋巴细胞从血流中向内皮细胞黏附。由于炎症反应被认为是贯穿于动脉粥样硬化病变始终的关键因素，故抑制炎症反应有利于改善动脉粥样硬化病变。基于此，随着主动脉对APN及其受体利用的增加和肝内APN抵抗的改善，其机体主动脉病变得到了一定程度的改善，其机制可能与补肾软坚方药调控APN及其下游炎症介质表达相关。