兔动脉粥样硬化模型的证候归属研究
动脉粥样硬化（AS）作为缺血性心脑血管疾病的病理基础，严重威胁人类的健康，开展对AS的研究具有重要的实际意义。动物实验研究是连接基础和临床的桥梁。近年开展的“病证结合模型”的研究为AS证候学的研究积累了丰富的经验，而将已建立的西医学病理模型进行中医学的证候归属性研究，无疑在病证结合的证候模型研究中具有重要的意义。本研究是在建立兔AS模型之后，对所有兔的中医证候学进行了观察，并进一步探求其证候学属性，为病证结合的中医实验学研究提供思路。
（一）材料
1.试验动物与分组 普通级雄性日本大耳白家兔24只，体重（2.0±0.2）kg（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供），适应性喂养1周后，按抽签法随机分成空白组（8只）和实验组（16只）。空白组给予普通饲料；实验组以高胆固醇饲料饲养，注射牛血清白蛋白及行球囊拉伤术。两组家兔均不限制饮水，分笼饲养，自由采食，共喂养10周。
2.主要试剂与仪器 胆固醇（分析纯）购自天津市英博生化试剂有限公司；胎牛血清白蛋白（Albumin Bovine fraction V）购自上海生物工程有限公司。4F导管（规格：215mm×1.2mm）购自上海上医康鸽医用器材有限责任公司，球囊由天津市医疗器械有限公司定做。血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）等测试盒均购自南京建成生物技术有限公司。OLYMPUS-BX40生物显微镜；200-型半自动生化分析仪（Humaly Company）；HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统，高分辨率三星数码相机等。
（二）方法
1.造模方法 24只家兔经普通饲料适应性喂养1周后予高脂饲料100g/只/日（早），普通饲料50g/只/日（晚），直至第10周取材。于第2周（高脂饲料喂养一周后）以胎牛血清白蛋白250mg/mL/kg，经耳缘静脉注射；第4周行经股动脉球囊扩张术，术前12小时禁食不禁水，用3%戊巴比妥钠（30mg/mL/kg）麻醉后将动物固定于手术台。左侧腹股沟周边区域备皮，沿股动脉走向切开皮肤，分离股动脉。结扎动脉远心端，用手术丝线轻轻提起动脉近心端以阻断近端血流。在动脉壁上约呈45°角“V”形剪开一小口，逆行插入肝素生理盐水（1∶15稀释）浸泡过的球囊导管（内置钢丝引导）至胸主动脉。送入约20cm，抽出导丝，连接于20mL注射器，注入约10mL空气，以球囊充盈为度，缓慢回拉球囊至髂总动脉附近（约10cm刻度处），重新插入导管，再牵拉1次，以确保内膜损伤。退出导管，结扎近心端。逐层缝合，以青霉素钠注射液冲洗创面。
2.模型评价
（1）主动脉大体观察 所有动物在第10周末麻醉后处死，取出主动脉纵切后肉眼观察。
（2）血脂水平检测 分别于实验0周、3周、6周、10周采血，采血前禁食12h，经耳缘静脉抽取空腹血3mL，静置1h后3000r/min离心10min，取血清置于－80℃冻存待用。甘油三酯（TG）（酶比色法）、胆固醇（TC）（酶比色法），采用半自动生化分析仪测定。
3.证候学研究
（1）证候学观察 所有动物定期观察耳、舌、眼、饮食情况、精神状况、活动量、粪便及死亡率，于10周末进行眼、舌的图像采集。
（2）生化指标评价 已有研究表明，痰为机体的代谢产物，其与氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）等密切相关，同时MDA、SOD也是心气虚的评价指标。本研究采用Thermo Multiskan MK3酶标仪（ELISA法）检测上述指标。
4.本实验符合《天津中医药大学实验动物管理保护条例》。
5.统计学方法 实验数据计量资料以x±s表示，采用t检验（SPSS 11.5统计软件），P＜0.05为有统计学差异。
（三）结果
1.模型建立情况
（1）主动脉大体观察 在第10周末取材中发现，空白组的主动脉柔韧均匀，颜色粉红，纵切后肉眼可见内膜光滑鲜亮；而实验组的主动脉粗细不均，血管明显增粗、变脆，外壁黄白相间、凹凸不平，纵切后肉眼可见管壁明显增厚、黄白色条纹或大小不等的黄白色脂质斑块向血管表面隆起。（见附录，图3-1a、图3-1b）
（2）血脂检测 实验组血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、随时间均呈上升趋势，且与同期空白组比较，在第3周、10周时差异均有统计学意义（P＜0.01）。而空白组血脂前后无显著变化。
表3-1 两组在造模过程中的血脂水平观察（mmol/L）（x±s）
2.证候学研究
（1）证候学观察 空白组动物精神状态良好，毛色呈雪白色，干净有光泽，目睛光亮有神，扑抓时反应灵敏、挣扎有力，饲喂时不断抓挠食盒。
实验组动物，从3周左右开始出现精神欠佳、活动量减少、懒于理毛，但饮食尚可，气候变化时鼻孔分泌物增多，耳郭红热，出现死亡；5周左右饲喂时较少有反应，喜卧少动，饮食有所减少，毛色变暗；7周左右发现目睛混浊，周围可见脂肪沉积斑或者圆形脂肪带，耳郭触之冰凉，血液回流差，粪便量少，粒小粘连，反应迟钝，气候变化时死亡数增多；至10周时精神差，对外界刺激反应迟钝，多寐，舌质紫黯或有瘀斑，耳郭青紫，耳缘采血困难。（见附录，图3-2）
表3-2 两组在造模过程中的证候学观察
（2）生化指标检测结果 两组动物10周末检测氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、脂质过氧化物如丙二醛（MDA）。结果显示，实验组ox-LDL明显增高，SOD活性降低，MDA的产生增多，与空白组比较差异均有显著性。
表3-3 血清ox-LDL、SOD、MDA含量在10周末的变化（x±s）
（四）讨论
兔动脉粥样硬化疾病模型的研究已经日趋成熟和规范，尤其高脂饮食造成兔动脉粥样硬化模型已经被公认并广泛应用。中医对疾病的良好临床疗效是建立在病证结合的诊疗模式之上的。病证结合的动物模型是研究中医药的理想途径，也是药物作用机理探讨的最佳平台和药效评价的最佳模式，故建立理想的病证结合动物模型是中医实验学的主要内容之一。
本研究通过高脂饮食、免疫损伤和球囊拉伤建立兔动脉粥样硬化模型，通过对实验动物宏观证候学诊断，结合并吸收证候实质的现代研究成果，归纳了兔动脉粥样硬化模型的证候学特征。研究发现，实验组家兔早期（即3周左右时）活动量逐渐减少，气候变化时出现鼻腔分泌物增多、呼吸有喘鸣、耳郭红热等感冒症状，此为气虚之证候，可能与第2周末注射牛血清白蛋白损伤免疫有关。至第7周左右，主要表现为气虚痰凝之候，家兔眼睛周围可见脂肪斑或者形成脂肪带，触之耳郭冰凉，血液循环差，精神萎靡呆钝，检查血脂明显高于空白组。至第10周左右，实验组家兔舌质暗红或有瘀斑，耳郭青紫冰凉，耳缘采血困难，取材时可见血管内有栓子形成，此为血瘀之证候。另外，根据证候的生物学基础研究结果，检测氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、脂质过氧化物如丙二醛（MDA）。结果显示，实验组ox-LDL明显增高，SOD活性降低，MDA的产生增多，与空白组比较差异均有显著性。
此项研究表明，在疾病模型稳定的情况下，动物的证候学是变化的。本方法建立的兔动脉粥样硬化模型在初期表现为气虚，中期表现为气虚痰凝，后期表现为气虚血瘀。这也与临床动脉粥样硬化的发病具有相似性。
建立更符合中医临床的动物模型，是中医实验学研究的重要内容之一。以往研究常以病因学模拟造模，而后以生物学指标判定，这在很大程度上忽略了中医证候诊断对模型的评判价值。但随着病证结合模型的探索和中医证候模型拟临床研究概念的提出，中医证候模型的研究将会更符合中医学的诊断评价标准。