补肾软坚方药单体TSG调控ERS-自噬途径干预血管内皮细胞凋亡的机制研究

四、补肾软坚方药单体TSG调控ERS-自噬途径干预血管内皮细胞凋亡的机制研究

血管内皮细胞的损伤及功能障碍是AS最早期的事件及发病的始动环节，维护血管内皮结构和功能的完整性对防治AS性疾病具有重要的意义。研究发现，在条件性敲除内皮细胞XBP1基因的小鼠的动脉血管中，自噬基因LC3β的表达低于基础水平。p-IRE1α激活的XBP1（s）mRNA与自噬基因Beclin1启动子在核苷酸-537~-755区域结合，通过Beclin1的转录调控诱导自噬小泡的形成，介导LC3β活化，触发自噬信号通路，进而根据自噬程度决定细胞生存或凋亡，影响AS进程。

既往研究已证实补肾软坚方药治疗AS性疾病疗效肯定，可以通过调节氧化应激和炎症反应来防治AS性疾病，其有效单体TSG能够通过保护血管内皮细胞来预防和保护AS发生发展。本实验观察TSG对Hcy诱导的内皮细胞凋亡及细胞凋亡率的影响，以及TSG对Hcy损伤内皮细胞IRE1-XBP1自噬途径中自噬小泡形成和GRP78、p-IRE1α、XBP1s、Beclin1、LC3β蛋白表达的影响。探讨TSG抗Hcy诱导内皮细胞凋亡的可能作用途径及相关调控机制，为AS的防治提供新的策略和治疗靶点。

（一）材料与方法

1.细胞株　EA.hy926人脐静脉细胞融合细胞株。

2.主要试剂和药品　胎牛血清（FBS）、噻唑蓝（MTT）、Hoechst33342/PI细胞凋亡与坏死检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、BCA法蛋白质浓度测定试剂盒、4×SDS蛋白上样缓冲液（含DTT）、彩色预染高分子蛋白质分子量标准品、ECL化学发光试剂盒、GRP78/BIP抗体（ab21685）、CHOP抗体（#2895）、beta-Actin抗体（bs-0061R）、羊抗兔IgG/HRP、p-IRE1α抗体（ab48187）、XBP1s抗体（#12782）、Beclin1抗体（ab21685）、LC3β抗体（L7543）、羊抗兔IgG/FITC、单丹磺酰尸胺（Mono dansyl cadaverine,MDC）、抗荧光衰减封片剂。

3.方法

（1）细胞培养　同第四章第四节。

（2）细胞分组与处理

培养细胞：取对数生长期的血管内皮细胞EA.hy926均匀接种于96孔培养板、24孔培养板、6孔培养板、25cm2培养瓶中。

同步化：待细胞贴壁并生长至融合状态后，弃去旧的培养液，D-hanks润洗2遍，用含0.5%FBS的DMEM培养基培养24h，使细胞周期同步于G0/G1期。

给药：弃去旧的培养液，D-hanks润洗2遍，各组处理方案如下：

①Control组：置换含0.5%FBS的DMEM高糖培养基继续培养48h。

②TSG组：置换含0.5%FBS和100μM TSG的DMEM高糖培养基继续培养48h。

③Hcy组：置换含0.5%FBS的DMEM高糖培养基继续培养24h后，置换含0.5%FBS和500μM Hcy的DMEM高糖培养基培养24h。

④Hcy＋TSG组：置换含0.5%FBS和100μM TSG的DMEM高糖培养基培养24h后，根据实验所用培养液含量，加入相应体积Hcy母液令其终浓度为500μM，继续对细胞进行干预24h。

⑤Hcy＋4-PBA组：置换含0.5%FBS和1mM 4-PBA的DMEM高糖培养基培养24h后，根据实验所用培养液含量，加入相应体积Hcy母液令其终浓度为500μM，继续对细胞进行干预24h。

（3）MTT比色法检测血管内皮细胞活力　同第四章第九节实验二。

（4）内皮细胞凋亡的形态学观察　同第四章第九节实验二。

（5）流式细胞术测定内皮细胞凋亡率　细胞接种于6孔板，校正组共4组，分别为空白对照组、阳性对照双染组、单染Annexin V-FITC组、单染PI组；实验组共5组，分别为Control组、50μM、100μM、500μM、1mM Hcy组，处理同“方法”（2）。给药干预结束后，同时处理实验组与校正组，离心、染色、进行流式细胞仪检测。

（6）MDC荧光染色检测内皮细胞自噬小泡

①给药干预结束后，弃去96孔培养板中旧的培养液，D-hanks润洗3次，2min/次。

②每孔中加入100μL MDC染色工作液，37℃培养箱中避光培养1.5h；1.5h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，PBS润洗3次，5min/次。

③4%多聚甲醛室温固定细胞15min，15min后弃去固定液，PBS润洗3次，5min/次。

④将96孔培养板放于倒置荧光显微镜下，观察细胞自噬小泡变化并拍照。

（7）免疫荧光法检测内皮细胞自噬调节蛋白Beclin1的表达　处理细胞爬片、细胞固定、封闭、一抗二抗反应、复染、封片和观察。

（8）Western blotting法检测内皮细胞　ERS相关蛋白GRP78、p-IRE1α、XBP1s和自噬相关蛋白Beclin1、LC3β的表达：提取总蛋白、BCA法测定细胞总蛋白的浓度、SDS-PAGE胶的制备、电泳、凝胶转膜、蛋白质免疫印迹反应、化学发光显影及凝胶图像分析。

4.统计学方法　运用SPSS 17.0对数据进行统计学处理，计量资料数据均用均值±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。

（二）结果

1.TSG对Hcy干预下血管内皮细胞活力的影响　TSG（100μM）组与Control组血管内皮细胞活力相比较，差异无显著性（P＞0.05）；与Hcy组比较，Hcy+TSG（100μM）组和Hcy+4-PBA（1mM）组能够明显增加血管内皮细胞活力，差异有显著性（P＜0.01）；而Hcy+TSG（100μM）组与Hcy+4-PBA（1mM）组相比较，提高血管内皮细胞活力的作用相近，差异不显著（P＞0.05）。说明100μM TSG可以有效提高Hcy诱导的血管内皮细胞活力下降，其作用不弱于1mM 4-PBA。实验重复3次，结果趋势相同。（见表4-13，图4-55）

2.TSG干预Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡的形态学观察

（1）倒置相差显微镜下观察细胞形态　倒置相差显微镜下观察发现（见附录图4-56），与Control组相比，Hcy组细胞贴壁能力降低，细胞间空隙加大，细胞数目明显减少，细胞皱缩变圆并且胞质出现大量空泡和颗粒物。用TSG和4-PBA干预后能够明显改善Hcy造成的细胞形态损伤，细胞数和细胞密度均明显提高，细胞形态趋于规则饱满，胞质中空泡和颗粒物明显减少。提示TSG和4-PBA干预后能明显减轻Hcy诱导的内皮细胞损伤，TSG具有抑制血管内皮细胞损伤的作用。

（2）倒置荧光显微镜下以Hoechst33342/PI染色检测细胞凋亡与坏死　经Hoechst 33342/PI染色后，于倒置荧光显微镜下观察内皮细胞的凋亡情况（见附录图4-57）。用紫外线激发后，Control组的内皮细胞核呈低密度均匀蓝染，细胞核形态规则，核膜完整，而Hcy组中细胞核数目较Control组减少，细胞核出现固缩，呈致密浓染，发出高亮度蓝色荧光，可见凋亡小体。与Hcy组相比，Hcy+TSG组和Hcy+4-PBA组中细胞核数增多，呈低密度均匀蓝染的细胞核比例增加，呈高亮度蓝色致密浓染的细胞核明显减少，提示凋亡细胞减少。用绿色光激发后，Control组少量细胞核呈低密度红色荧光或大量细胞核不被PI着色，而Hcy组中部分细胞核呈现致密浓染的高亮度红色荧光，用TSG和4-PBA干预后，呈高亮度红色荧光的细胞核明显减少，提示坏死细胞减少。表明TSG和4-PBA可以明显减少Hcy诱导的内皮细胞凋亡和坏死，TSG具有抑制内皮细胞凋亡的作用。

3.TSG干预Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡率测定　根据流式细胞仪检测结果（见表4-14，附录图4-58，图4-59），与Control组相比，Hcy组细胞存活率明显下降，细胞凋亡率明显增高，差异均具有显著性（P＜0.01）。与Hcy组相比，Hcy＋TSG（100μM）组和Hcy＋4-PBA（1mM）组均能够明显提高细胞存活率，降低细胞早期凋亡率与总死亡率，差异均具有显著性（P＜0.01）。而将Hcy＋TSG（100μM）组和Hcy＋4-PBA（1mM）组对内皮细胞存活率和凋亡率的影响相比较，差异不显著（P＞0.05）。实验重复3次，结果趋势相同，提示TSG和4-PBA可以明显下调Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡率，TSG具有抑制内皮细胞凋亡的作用，并且作用不弱于4-PBA。

4.TSG对Hcy诱导的血管内皮细胞自噬的影响

（1）倒置荧光显微镜下以MDC染色检测细胞自噬小泡　MDC染色后，使用倒置荧光显微镜观察内皮细胞自噬小泡的情况（见附录图4-60）。通过紫外激发MDC，Control组的内皮细胞中酸性自噬小泡呈现出高亮度蓝绿色荧光，胞质形态规则，而Hcy组中细胞胞浆呈低亮度不均匀蓝绿色。与Hcy组相比，Hcy+TSG组和Hcy+4-PBA组中高亮度均匀蓝绿色荧光增多，提示细胞中自噬小泡增多。

（2）倒置荧光显微镜下观察细胞自噬调节蛋白Beclin1的表达　荧光显微镜下观察内皮细胞胞浆中自噬调节蛋白Beclin1分布变化情况（见附录图4-61）。Beclin蛋白用FITC标记，激发光为蓝色荧光，发射光为绿色荧光。用蓝色荧光激发后，Control组的内皮细胞胞浆呈致密浓染，发出高亮度绿色荧光，胞质形态规则，而Hcy组中细胞胞浆呈低亮度绿染，无完整胞质形态。与Hcy组相比，Hcy+TSG组和Hcy＋4-PBA组中规则形态的细胞胞质增多，呈高亮度均匀绿染，呈低亮度绿染的不规则形态胞质明显减少，提示细胞自噬增加。通过紫外激发DAPI来观察细胞核的位置和形态变化，Control组细胞核呈均匀蓝染，而Hcy组中细胞核呈现不均匀的蓝色荧光，提示细胞受损。用TSG和4-PBA干预后，呈高亮度致密蓝染的固缩状细胞核明显减少，提示凋亡细胞减少，表明TSG和4-PBA可以提高受损内皮细胞的自噬水平和抑制细胞凋亡。

5.TSG对Hcy诱导的血管内皮细胞ERS相关蛋白GRP78、p-IRE1α、XBP1s和自噬相关蛋白Beclin1、LC3β表达的影响　如图4-62所示，与Control组比较，Hcy组ERS标志蛋白GRP78表达明显增加；与Hcy组比较，用TSG和4-PBA干预后能够明显减少Hcy诱导的GRP78蛋白表达，差异均具有显著性（P＜0.01）。初步表明TSG和4-PBA可以抑制Hcy诱导的ERS发生。

如图4-63所示，与Control组比较，Hcy组p-IRE1α、XBP1s表达增加，自噬调节蛋白Beclin1表达明显减少，差异具有显著性（P＜0.05或P＜0.01），与Hcy组比较，TSG和4-PBA干预组能够明显减少p-IRE1α、XBP1s蛋白表达，增加Beclin1蛋白表达，差异具有显著性（P＜0.05或P＜0.01）。而Hcy+TSG（100μM）组与Hcy+4-PBA（1mM）组相比较，p-IRE1α、XBP1s和Beclin1蛋白表达量相近，差异不显著（P＞0.05）。如图4-64所示，与Control组比较，Hcy组自噬蛋白LC3β-II/I相对表达量减少，差异具有显著性（P＜0.05）。与Hcy组比较，用TSG和4-PBA干预后能够明显提高LC3β-II/I蛋白相对表达量，差异具有显著性（P＜0.01）。实验重复3次，结果趋势相同，表明TSG和4-PBA均可以抑制Hcy诱导的ERS相关蛋白GRP78、p-IRE1α、XBP1s表达，同时促进自噬相关蛋白Beclin1、LC3β-II/I表达，提示TSG可能通过ERS自噬途径抑制血管内皮细胞凋亡。

（三）讨论

AS是中老年人普遍存在的一种病变，其本质是人类随着衰老而发生的动脉壁退行性病理变化。从固护正气、抵御邪气的角度入手，能够提高防治AS的效果。血管内皮细胞的损伤及功能障碍是AS最早期的事件及发病的始动环节，在AS早期内皮细胞凋亡可以促进斑块形成。因此，维护血管内皮结构和功能的完整性在防治AS性疾病中具有重要的意义。运用中医药理论和方法，在AS发生早期斑块尚未完全成形之际，通过保护内皮细胞对早期AS进行干预以逆转或延缓本病的发展，以期为防治AS提供新的思路和方法。

国医大师阮士怡教授认为AS发生及斑块形成的主要病机在于“脾肾虚衰，痰浊停滞”，在此病机理论的指导下，研制了具有“益肾健脾、软坚散结”之功效的补肾软坚方药。本研究探讨了补肾软坚方药有效单体TSG抗Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡的作用机制，初步揭示了TSG具有抗Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡作用与IRE1-XBP1自噬途径相关。细胞根据ERS强度决定生存死亡，而这一过程与XBP1s密切相关，XBP1s途径可能存在一种“开关”机制去调控细胞存亡。细胞的凋亡与自噬是近年的研究热点，二者相互影响，由ERS引起的细胞凋亡与自噬之间存在交互作用。有研究指出，在巨噬细胞中XBP1s瞬时过表达诱导自噬，并通过下调Beclin1促进巨噬细胞增殖，但其持续过表达会导致细胞凋亡。

本研究通过培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926，建立Hcy诱导内皮细胞凋亡与ERS损伤模型，筛选Hcy损伤模型最佳作用浓度，结合中医“益肾健脾、软坚散结”的理论，以补肾软坚方药有效单体TSG为干预手段，以IRE1-XBP1自噬途径为切入点，在细胞层面研究TSG在防治AS保护血管内皮细胞过程中所发挥的作用。观察TSG抗Hcy诱导内皮细胞凋亡情况，以及TSG对Hcy诱导内皮细胞凋亡途径中ERS相关蛋白GRP78、p-IRE1α、XBP1s、自噬相关蛋白Beclin1、LC3β表达的影响，初步探讨了TSG抗Hcy诱导内皮细胞凋亡的作用及其机制。研究所得结论如下：

①高浓度的Hcy具有一定细胞毒性，Hcy诱导内皮细胞凋亡及ERS损伤模型最佳浓度为500μM。

②TSG具有抗Hcy诱导内皮细胞损伤的作用，能够提高受损内皮细胞的活力。

③TSG能够减少Hcy诱导内皮细胞凋亡数目，降低细胞凋亡率，表明TSG具有抑制Hcy诱导内皮细胞凋亡的作用。

④TSG能够抑制Hcy诱导的ERS相关蛋白GRP78、p-IRE1α、XBP1s表达，促进自噬相关蛋白Beclin1、LC3β-II/I表达，表明TSG可能是通过IRE1-XBP1途径影响内皮细胞自噬水平，进而调控Hcy诱导的内皮细胞凋亡。