补肾软坚方药对颈动脉外膜损伤致粥样硬化兔Rho/ROCK通路表达的影响
动脉粥样硬化是危害人类健康的常见病，是各种心脑血管事件（心肌梗死、心脏性猝死、脑卒中）发生的重要病理基础。传统观点认为，动脉粥样硬化起始于各种原因所致的内皮损伤，导致低密度脂蛋白在内膜沉积和氧化，单核巨噬细胞渗入内膜下或中膜表型改变的平滑肌细胞迁入内膜，吞噬被氧化的低密度脂蛋白，继而形成泡沫细胞，引发内膜炎症反应，随着越来越多泡沫细胞的形成，炎症反应扩散到中膜甚至外膜，最终导致由内而外的血管壁弥漫性炎症反应。然而，越来越多的实验研究证明，血管外膜在氧化应激和损伤修复中起重要作用，在动脉粥样硬化的发生发展中往往先于内膜损伤发生变化。
因此，本实验以颈动脉外膜损伤致粥样硬化模型为研究对象，以补肾软坚方药为干预药物，采用Q-PCR法检测Rho/ROCK通路mRNA的表达，探讨外膜损伤致AS模型Rho/ROCK通路的表达情况及补肾软坚方药的干预效应。
（一）材料与方法
1.实验动物 清洁级健康成年雄性新西兰兔72只，体重（2.2±0.2）kg。
2.主要试剂与药品 补肾软坚方药，阿托伐他汀钙片，RnaExTM Total RNA Isolation、Rayscript cDNA Synthesis KIT、注射用青霉素钠。
3.方法
（1）造模 高脂饲料喂养，剔除血脂水平正常者。实验动物以3%戊巴比妥钠（1mL/kg）经耳缘静脉注射麻醉、固定，于颈部正中切口，以胰酶消化法联合机械剥离法损伤兔一侧颈动脉外膜，对侧颈动脉行假手术处理。
（2）分组给药 术后随机分为模型组、补肾软坚组、阿托伐他汀组，每组分4个亚时间点（术后1周、4周、8周、12周），每组6只。给药组于术后第二天给药，阿托伐他汀组给予阿托伐他汀钙片5mg/kg/d，补肾软坚组给予补肾软坚方药1g/kg，2次/d，模型组给予等量生理盐水灌胃。
（3）取材 各组实验动物分别于术后第1周、4周、8周、12周末麻醉、固定、心脏灌注后，取双侧颈动脉，用锡纸包裹，于-80℃冰箱保存，用于光镜观察。
4.标本检测项目
（1）常规病理学检查 双侧颈动脉经10%的中性福尔马林固定后，常规脱水、包埋，切片厚5μm，行HE染色，光镜下观察。
（2）Q-PCR法检测RhoA、ROCK1、ROCK2、MLCK、MLCP的mRNA的表达 采用Trizol法提取总RNA，紫外分光光度仪测mRNA的浓度和纯度，用逆转录试剂盒转录成cDNA，每个标本均进行RhoA、ROCK1、ROCK2、MLCK、MLCP的mRNA和内参GAPDH的荧光定量PCR。反应条件95℃变性10sec，60℃退火/延伸30sec，40个循环。（见表3-44）
表3-44 目的基因及内参基因引物序列
根据Q-PCR原始检测结果，采用2-ΔΔCt法进行数据的相对定量分析，ΔΔCt=（待测样品目的基因平均Ct值－待测样品内参基因平均Ct值）－（对照样品目的基因平均Ct值－对照样品内参基因平均Ct值）。
5.统计学方法 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析，多组样本之间的比较采用单因素方差分析和重复测量的多因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异非常显著。
（二）结果
1.一般形态学改变 损伤侧血管的病变明显早于、重于自身对照侧血管；随着时间的延长，损伤的外膜在逐渐恢复，厚度在逐渐增加；给药组颈动脉内膜增生程度逐渐加重，损伤外膜逐渐恢复（见附录，图3-95）。但两组病变程度差异较小。与模型组相比，两给药组病变程度均有不同程度的减轻，但阿托伐他汀组较补肾软坚组病变程度轻。结果提示，补肾软坚方药可以减轻外膜损伤致粥样硬化模型内膜增生程度，达到防治动脉粥样硬化性疾病的目的。
2.RhoA、ROCK1、ROCK2、MLCK、MLCP的mRNA的表达 与对照侧相比，外膜损伤侧颈动脉RhoA、ROCK1、ROCK2、MLCK、MLCP的mRNA表达水平显著升高，提示Rho/ROCK通路被激活，而阿托伐他汀组和补肾软坚组RhoA、ROCK1、ROCK2、MLCK、MLCP的mRNA表达水平均有不同程度的下降，至术后12周，两给药组之间差异有显著性（P＜0.05）。提示补肾软坚方药可以通过调节Rho/ROCK通路，改善细胞骨架结构的破坏，抑制内膜增生。（见图3-96~图3-100）
图3-96 各组颈动脉RhoA mRNA相对表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-97 各组颈动脉ROCK1 mRNA相对表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-98 各组颈动脉ROCK2 mRNA相对表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-99 各组颈动脉MLCK mRNA相对表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
图3-100 各组颈动脉MLCP mRNA相对表达水平
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
（三）讨论
Rho/ROCK通路在AS中发挥重要作用，参与AS形成的各个环节：Rho/ROCK信号通路可以直接调控eNOS过表达和激活所导致的内皮功能损伤；可以破坏紧密连接、黏附连接形成的细胞与细胞间的屏障，破坏细胞骨架联合复合体，进而破坏内皮完整性；可以直接磷酸化MLC或抑制MLCP活化，使得MLC磷酸化水平升高，引起细胞收缩，细胞与细胞分离形成间隙，内皮细胞间通透性增加；此外，Rho/ROCK通路还参与AS形成过程中的其他环节，如通过影响黏附分子的表达，促进白细胞向内皮下迁移浸润。
本研究以外膜损伤致AS模型为研究对象，观察Rho/ROCK通路在外膜损伤致AS模型中的作用。结果显示，与对照侧相比，外膜损伤侧颈动脉RhoA、ROCK1、ROCK2、MLCK、MLCP的mRNA表达水平显著升高，提示Rho/ROCK通路被激活，细胞骨架结构和紧密连接结构被破坏，激活的成纤维细胞可以通过内皮细胞的间隙向内膜下增殖、迁移，促进AS的形成和发展。而阿托伐他汀组和补肾软坚组RhoA、ROCK1、ROCK2、MLCK、MLCP mRNA表达水平均有不同程度的下降，至术后12周，两给药组之间差异有统计学意义，提示补肾软坚方药可能通过调节Rho/ROCK通路，改善细胞骨架结构，抑制内膜增生，减缓AS发展进程，从一个较新的角度阐释了补肾软坚方药治疗AS的药理机制。