补肾软坚方药从PI3K/Akt/mTOR信号通路调控巨噬细胞自噬的机制
动脉粥样硬化是一种脂质代谢失衡性疾病，也是一种进程缓慢的、机制复杂的血管炎症性疾病。疾病产生初期由于炎症反应激活造成了内皮细胞损伤，单核细胞黏附于受损内皮表面，并迁移到内皮下形成巨噬细胞，巨噬细胞吞噬修饰的脂质形成泡沫细胞。随着疾病继续发展，泡沫细胞等凋亡和坏死造成了坏死脂质核心、炎症反应激活、脂质代谢异常、细胞凋亡、内质网应激和自噬。最近研究表明，巨噬细胞自噬在AS病理发生、发展的过程中扮演着不可或缺的角色。本实验建立巨噬细胞自噬模型，运用补肾软坚方药和Rapamycin预干预24h，采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测巨噬细胞PI3K、Akt、mTOR、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达情况，探讨补肾软坚方药调节巨噬细胞自噬的通路机制。
（一）材料与方法
1.细胞株 小鼠RAW264.7巨噬细胞株购自国家实验细胞资源共享平台（China Infrastrcture of Cell Line Resource）。
2.主要试剂 氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、Rapamycin、补肾软坚方药、BCA蛋白定量试剂盒、0.45μmPVDF膜、BSA、彩色预染高分子蛋白质分子量标准、ECL发光试剂盒、HRP-goat anti-rabbit IgG、兔抗Akt单克隆抗体、兔抗p-Akt单克隆抗体、兔抗mTOR单克隆抗体、兔抗β-actin多克隆抗体、兔抗PCNA多克隆抗体、兔抗PI3K单克隆抗体。
3.方法
（1）巨噬细胞RAW264.7的培养 RAW264.7巨噬细胞株常规培养，DMEM中加入10%的胎牛血清和1%的双抗，置于37℃、5% CO2培养箱培养。待细胞状态良好、贴壁生长面积约90%，分瓶传代，弃去培养瓶内的原有培养液，加入D-hanks液3mL润洗两遍，加入3mL DMEM，用细胞刮刀使细胞脱壁，移入15mL离心管，1000rpm离心5min，弃上清液后加入3mL培养基重悬细胞，1∶6传入新的培养瓶，置于培养箱中培养。
（2）药物干预 细胞传代处理，用计数板细胞计数，传入六孔板，调整细胞密度为2×105个/孔，继续培养。第二天细胞贴壁后换液，分四组加药干预：正常对照组、ox-LDL组、ox-LDL＋补肾软坚方药干预组、ox-LDL＋补肾软坚方药＋mTOR抑制剂Rapamycin干预组（以下依次简称为正常组、模型组、补肾软坚组和Rapamycin组）。
（3）Western blotting检测自噬相关蛋白 将各实验分组细胞弃细胞上清液后加入100μL裂解液反复吹打后，收集裂解液置于高速冷冻离心机中得待测样品。将待测样品做BCA蛋白定量及SDS-PAGE电泳实验，得各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白条带。
4.统计学方法 用Image-Pro Plus 6.0软件计算各组蛋白条带的灰度值。标准化蛋白相对表达倍数值=（实验组目的蛋白条带灰度值÷该组内参蛋白条带灰度值）÷（正常组目的蛋白条带灰度值÷正常组内参蛋白条带灰度值）。将各次实验计算得出的标准化蛋白相对表达倍数值用SPSS 17.0软件进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。
（二）结果
1.补肾软坚方药对巨噬细胞自噬模型PI3K蛋白表达的影响 与正常组相比，模型组PI3K蛋白的表达升高，差异有显著性（P＜0.05）；与模型组相比，补肾软坚组与Rapamycin组细胞PI3K蛋白的表达明显降低，差异非常显著（P＜0.01）。（见图4-19）
图4-19 各组巨噬细胞内PI3K蛋白表达情况
注：与正常组相比，aP＜0.01，bP＜0.01；与模型组相比，dP＜0.01。
2.补肾软坚方药对巨噬细胞自噬模型Akt、p-Akt蛋白表达的影响 正常组、模型组、补肾软坚组与Rapamycin组间Akt蛋白表达的差异不显著。与正常组相比，模型组p-Akt蛋白的表达升高，差异有显著性（P＜0.05）；与模型组相比，补肾软坚组与Rapamycin组p-Akt蛋白的表达降低，差异非常显著（均为P＜0.01），补肾软坚组与Rapamycin组差异不显著。（见图4-20）
图4-20 各组巨噬细胞内p-Akt蛋白表达情况
注：与正常组相比，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组相比，dP＜0.01。
3.补肾软坚方药对巨噬细胞自噬模型mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 与正常组相比，模型组细胞mTOR蛋白的表达降低，差异不显著；与模型组相比，补肾软坚组与Rapamycin组细胞mTOR蛋白的表达降低，差异有显著性（P＜0.01）。Rapamycin组与补肾软坚组相比，差异不显著。与正常组相比，模型组细胞p-mTOR蛋白的表达升高，差异有显著性（P＜0.05）；与模型组相比，补肾软坚组与Rapamycin组p-mTOR蛋白的表达降低，差异有显著性（均为P＜0.05）。（见图4-21、图4-22）
图4-21 各组巨噬细胞内mTOR蛋白表达情况
注：与正常组相比，bP＜0.01；与模型组相比，dP＜0.01。
图4-22 各组巨噬细胞内 p-mTOR 蛋白表达情况
注：与正常组相比，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组相比，cP＜0.05，dP＜0.01；与补肾软坚组相比，eP＜0.01。
（三）讨论
mTOR信号通路的激活依赖于上游信号PI3K/Akt通路的启动，其中PI3K是一类特异性磷酸化肌醇磷脂3位羟基激酶，PI3K根据其结构特点和底物特异性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3种类型，Ⅰ型又分为ⅠA和ⅠB两种亚型。在受到胰岛素、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血管位蛋白Ⅰ等生长因子的刺激后，PI3KⅠA亚型便会通过细胞表面的酪氨酸蛋白激酶受体（receptor tyrosine kinases，RTK）被激活，继而激活下游的蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），又称为Akt，Akt亦有1、2、3三种类型，其中Akt 1可以促进细胞的增殖和存活；Akt 3则有调节细胞的数目及大小的功能，这对于整条PI3K/Akt/mTOR信号通路在细胞自噬与凋亡中的角色都有着重要的意义。
本部分实验通过蛋白质印迹法观察了补肾软坚方药对PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响。结果显示，ox-LDL 100μg/mL刺激巨噬细胞可激活PI3K信号通路，可导致PI3K通路相关蛋白PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达均明显升高。补肾软坚方药能够抑制PI3K蛋白表达、抑制下游p-Akt、p-mTOR蛋白的表达，说明补肾软坚方药可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白的表达，上调AS自噬相关蛋白的表达。Rapamycin组能够直接作用于mTOR，直接抑制mTOR和p-mTOR蛋白的表达，上调细胞自噬。各组间Akt蛋白表达无明显差异，主要是由于Akt、mTOR的磷酸化是其活化的标志，其在磷酸化后才能发挥生物学效应，而总的Akt、mTOR并不能很好反应通路被激活的情况。补肾软坚方药可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白的表达，上调AS自噬相关蛋白的表达，抑制AS的发生发展，从一个较新的角度阐释了补肾软坚方药治疗AS的药理机制。