补肾软坚方药基于PI3K/Akt/mTOR信号通路调节动脉粥样硬化兔细胞自噬的机制研究
动脉粥样硬化（AS）是动脉管壁内膜的一种慢性炎症性疾病，以血管壁产生粥样斑块为特征，发病率高且严重危害人类健康。随着基础研究和临床研究的不断深入，新近的研究结果显示，自噬在AS发生发展的过程中发挥了重要作用，适度的自噬可以抑制AS的发生发展，而过度的自噬则不利于AS斑块的稳定。中药通过多途径、多靶点防治AS，其机制可能与调控AS斑块内细胞自噬有关。因此，从自噬角度深入了解补肾软坚方药对AS的影响及其分子机制，将为补肾软坚方药防治AS提供新的策略与治疗靶点。
（一）材料与方法
1.实验动物 清洁级健康成年雄性新西兰兔24只，体重（2.2±0.2）kg。
2.主要试剂与药品 补肾软坚方药，阿托伐他汀钙片，戊巴比妥钠，GAPDH鼠单克隆抗体，山羊抗兔IgG多克隆抗体，山羊抗鼠IgG。PI3K兔单克隆抗体，Akt兔单克隆抗体，P-Akt兔单克隆抗体，mTOR兔多克隆抗体，P-mTOR兔单克隆抗体。
3.方法
（1）造模分组 健康雄性新西兰兔24只，随机分为4组：对照组、模型组、补肾软坚组、阿托伐他汀组，每组6只，实验周期12周。对照组喂养普通饲料，其余3组均用高脂饲料喂养。
（2）给药 高脂饮食喂养4周，补肾软坚组以补肾软坚方药（1g/kg·d）溶于生理盐水中灌胃给药，阿托伐他汀组给予阿托伐他汀钙片（5mg/kg·d）治疗，模型组以等体积生理盐水灌胃。
（3）取材 实验动物于第12周末以3%戊巴比妥钠（30mg/mL/kg）经耳缘静脉注射进行麻醉，固定取血，心脏灌注取主动脉，锡纸包好置于冻存管内，－80℃冰箱内保存备用。
4.标本检测项目 将各实验分组组织弃上清液后加入100μL裂解液反复吹打，收集裂解液置于高速冷冻离心机中制得待测样品。将待测样品做BCA蛋白定量及SDS PAGE电泳实验，得各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白条带。
5.统计学方法 用Image-Pro Plus 6.0软件计算各组蛋白条带的灰度值。标准化蛋白相对表达倍数值=（实验组目的蛋白条带灰度值÷该组内参蛋白条带灰度值）÷（Control 组目的蛋白条带灰度值÷Control组内参蛋白条带灰度值）。将各次实验计算得出的标准化蛋白相对表达倍数值用SPSS 16.0软件进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示。多组之间比较首先进行正态性和方差齐性检验，符合正态性采用单因素方差分析（One-way ANOVA）；多组间两两比较，若方差齐时采用LSD-t检验，P＜0.05为差异具有显著性，P＜0.01为差异非常显著。
（二）结果
Western blotting检测PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白的表达。结果显示（见附录，图3-101~图3-103），与对照组相比，模型组PI3K蛋白的表达升高；与模型组相比，补肾软坚组PI3K蛋白的表达降低，表明补肾软坚方药抑制了PI3K蛋白的表达。与对照组相比，模型组P-Akt、P-mTOR蛋白的表达均升高；与模型组比较，补肾软坚组P-Akt、P-mTOR蛋白的表达均降低。提示补肾软坚方药抑制Akt、mTOR蛋白的表达。
（三）讨论
近些年来，关于自噬分子机制的相关研究取得了较大的进展。磷脂肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase,PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）-雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin ，mTOR）信号通路广泛存在于多种细胞内，通过影响下游多种效应分子的活化状态，参与体内多种生理病理过程，包括细胞的增殖、存活和迁移等，在自噬中也发挥着关键的调节作用。PI3K是生长因子受体酪氨酸激酶下游主要的信号元件之一，PI3K通过催化位于细胞膜的脂性第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3），激活下游信号分子丝氨酸苏氨酸激酶（Akt），而活化的Akt通过磷酸化激活其下游的mTOR。
实验深入探究补肾软坚方药通过调节自噬抗AS的分子机制，采用蛋白质印迹法观察了补肾软坚方药对PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响。结果显示，与对照组相比，模型组PI3K蛋白的表达升高；与模型组相比，补肾软坚组PI3K蛋白的表达降低，表明补肾软坚方药抑制了PI3K蛋白的表达。Akt、mTOR的磷酸化是PI3K活化的标志，磷酸化的PI3K才能发挥生物学效应，而总的Akt、mTOR并不能很好地反应通路激活的情况。结果显示，与对照组相比，模型组P-Akt、P-mTOR蛋白的表达均升高；与模型组比较，补肾软坚组P-Akt、P-mTOR蛋白的表达均降低，提示补肾软坚方药抑制了Akt、mTOR蛋白的磷酸化。补肾软坚方药可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白的表达，上调AS兔细胞自噬相关蛋白的表达，进而抑制AS的发生发展，从自噬分子机制的角度阐释了补肾软坚方药治疗AS的药理机制。