补肾软坚方药影响缺氧内皮细胞eNOS mRNA和ET-1 mRNA的研究

第二节　补肾软坚方药影响缺氧内皮细胞eNOS mRNA和ET-1 mRNA的研究

血管内皮是非常重要的内分泌腺，以NO为代表的内皮源性舒张因子与以内皮素ET-1为代表的内皮源血管收缩因子的分泌和调节平衡功能失调，是内皮功能异常和内皮细胞损伤的重要特征，血管内皮损伤是许多心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭等病理过程中基本病理表现。生理状态下，NO和ET-1的合成和释放与eNOS mRNA和ET-1 mRNA的表达处于相对平衡状态，以维持心血管系统正常的舒缩功能，但是在缺氧、感染、细胞损伤等病理条件刺激下，这种平衡状态出现异常或失衡，这可能是血管内皮或内皮细胞功能障碍的早期表现，运用药物抑制这种基因表达的异常，或许是早期恢复内皮细胞生理功能和防治心血管系统常见疾病的一个重要途径。以培养的人脐静脉内皮细胞为研究对象，探讨中药补肾软坚方药是否通过阻抑缺氧内皮细胞eNOS mRNA和ET-1 mRNA的异常表达，维持eNOS mRNA和ET-1 mRNA的平衡，从而阻抑NO和ET-1合成与释放的失衡，进而发挥对内皮细胞的保护作用，具有重要的意义。

（一）材料与方法

1.实验动物　普通级雄性日本大耳白兔，体重（2.2±0.2）kg。

2.试剂与药品　维生素C，Factor Ⅷ - related Antigen，内皮细胞生长因子，D-MEM/F12，总RNA提取盒，逆转录酶MMLV，Taq DNA聚合酶。

3.方法

（1）补肾软坚方药含药血清的制备　同第二章第三节。

（2）缺氧内皮细胞模型的建立　同第四章第一节。

（3）分组及给药　同第四章第一节。

4.Rt-PCR检测标本　采用异硫氰酸肌-酚-氯仿法提取各组细胞总RNA，测定其纯度和量。每组按5μg的量进行逆转录；分别取2μg的总RNA为模板，对eNOS和ET-1目的基因及内对照GAPDH基因进行RT-PCR扩增。三对引物的变性温度和时间均为94℃、1min，延伸温度和时间均为72℃、1min，退火温度和时间分别为58℃、50sec，56℃、50sec，60℃、50sec，均为35个循环。将eNOS、ET-1和GAPDH的PCR扩增产物在含有溴化乙锭（EB）的1%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下照相，将底片进行吸光度扫描定量，以GAPDH的吸光度为内对照。引物序列见表4-2。

5.统计学方法　运用激光扫描仪，使用VDS图像分析软件，对各组电泳条带进行定量，得其吸光度（A值），比较空白组、模型组、实验组之间增加表达的倍数。

（二）结果

1.内皮细胞总RNA的纯度、完整性　用promega试剂盒RNAgents Tota 1 RNA Iso 1ation system提取的内皮细胞总RNA经 1%的琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色，紫外灯下观察可见两条清晰的rRNA纯带（28s和18s），且28s∶18s≈2∶1，经DU-530核酸蛋白仪对RNA纯度进行鉴定OD260/OD280比值范围在1.8~2.0之间。总RNA电泳图谱证实RNA完整性较好。

2.ET-1 mRNA和eNOS mRNA的表达　培养的人脐静脉内皮细胞经缺氧处理4小时后，缺氧组（模型组）ET-1 mRNA表达最高而eNOS mRNA表达最低（P＜0.01）；中西药组ET-1 mRNA表达均下调，eNOS mRNA表达均上调（P＜0.01，P＜0.05）；中药组明显优于西药组（P＜0.05）。以上结果说明，缺氧能促进内皮细胞ET-1 mRNA表达而降低eNOS mRNA表达，抗氧化剂Vit-C和补肾软坚方药能阻抑缺氧内皮细胞ET-1 mRNA和eNOS mRNA的异常表达，而中药作用优于西药Vit-C，定量分析结果如下。

（三）讨论

NO与ET-1是心血管系统中两种重要的生物活性介质，二者主由血管内皮细胞合成和释放。病理状态下，体内外各种异常刺激因素，缺血、缺氧、血流脉冲切应力变化、氧自由基生成增加、氧化型低密度脂蛋白水平增加等都可使内皮细胞eNOS mRNA/ET-1 mRNA之间的表达及NO/ET-1之间的分泌平衡失调，并向ET-1倾斜，这是内皮功能障碍的早期表现，而内皮功能障碍与心血管系统疾病，尤其是与动脉粥样硬化、高脂血症等的形成密切相关。低氧时血管内皮细胞是组织中受攻击的第一道靶器官，内皮受损后，其释放的重要血管内皮衍生舒张因子NO严重减少，而ET-1释放增加，从而使内皮依赖性舒张功能受限。

在我们本次研究中发现，补肾软坚方药能显著阻抑缺氧内皮细胞NOS活性降低和NO释放减少，而抑制ET的释放，且中药的作用优于西药组。说明补肾软坚方药通过上述途径对内皮细胞的保护作用，可能是其抗动脉粥样硬化作用的机制之一。