补肾软坚方药干预血细胞黏附聚集影响动脉粥样硬化的机制研究
AS易损斑块是脑卒中、心肌梗死、心脏性猝死的病理基础。它不仅指所有易于发生血栓的斑块，还包括所有可能快速进展为罪犯斑块的粥样病变。而血栓形成和炎症反应是斑块易损的关键环节。白细胞与血管内皮细胞黏附增强是炎症发生的先决条件，易引起白细胞跨内皮细胞移行，并在炎症部位聚集；反之，炎症反应亦能加速附壁血栓形成，促使急性心脑血管事件发生。
（一）材料与方法
1.实验动物 雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，7~8周龄，体重（21±2）g。雄性ApoE-/- 小鼠，SPF级，7~8周龄，体重（21±2）g。
2.主要试剂及药品 苏木素-伊红染色试剂盒、Russell改良Movat五色套染染色液、0.45μm PVDF膜、4×蛋白上样缓冲液（含DTT）、BCA蛋白定量试剂盒、磷酸酶混合抑制剂、BSA、彩色预染高分子蛋白质分子量标准、RIPA组织/细胞裂解液、ECL Plus超敏发光液、兔抗AdipoR2多克隆抗体、兔抗T-cadherin多克隆抗体、兔抗TLR4单克隆抗体、兔抗p-NF-κB p65单克隆抗体、兔抗I-κB单克隆抗体、兔抗Adiponectin单克隆抗体、兔抗AdipoR1单克隆抗体、山羊抗兔二抗HRP标记、兔抗β-Actin单克隆抗体、小鼠MCP-1 ELISA试剂盒、小鼠VCAM-1 ELISA试剂盒、补肾软坚方药、阿托伐他汀钙片。
3.方法
（1）实验分组及给药 将ApoE-/-小鼠随机分为模型组（等体积蒸馏水，灌胃）、阿托伐他汀组（0.003g/kg，灌胃）、补肾软坚组（1.365g/kg，灌胃）每组10只，并以C57BL/6J小鼠10只作为对照组。补肾软坚方药与阿托伐他汀钙片的给药剂量参考徐叔云教授主编的《药理实验方法学》，计算小鼠和人之间的等效剂量，并均以生理盐水将其配制成溶液灌胃。于第6周开始灌胃，各组小鼠每天给药1次，每周称取小鼠体重，第12周末取材。所有的动物饲养条件和实验流程都严格按照动物实验伦理委员会的规章和制度执行。
（2）标本采集与处理 分别于干预6周、12周后取材。取材前小鼠禁食12h，采用摘眼球取血。取血后，迅速开腹摘取心脏，于4℃生理盐水中洗去血液，滤纸吸干，将心脏放入10％的中性福尔马林液中固定保存；之后从主动脉根至腹主动脉末端分叉处分离出整条主动脉，于4℃生理盐水中洗去血液，滤纸吸干，用锡纸包裹主动脉组织放入冻存管，即刻置于液氮罐中，转置于－80℃冰箱保存，待测。室温下血液自然凝固30min后，离心（3000r/min，10min），取上清液转移至离心管，放置于－80℃冰箱保存，待测。
（3）血清脂质检测 取出－80℃冰箱保存血清，全自动生化分析仪检测血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C。
（4）主动脉窦石蜡切片的制备及染色 将于10％中性福尔马林液中固定36h后的心脏取出，将与心尖平行的左心耳与右心耳下连线（连带部分心室肌）横切，将改刀后的上半部分心脏组织放入包埋盒中进行制片。将制备好的载玻片进行HE染色及Russell改良Movat五色套染染色。
（5）Western blotting检测主动脉组织脂联素及其受体、TLR4-NF-κB通路蛋白表达水平 将冻存的主动脉组织取出，称重，按比例加入裂解液，离心收集待测样本蛋白。测定样品蛋白浓度，SDS-PAGE电泳实验获得蛋白条带数据。
（6）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组血清中VACM-1表达水平 按试剂盒说明书操作，获得各浓度标准品，制作标准曲线，依次加样，孵育，最终获得各孔板OD值。
4.统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件，数据以均值±标准差（x±s）表示，两组间数据比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，首先对数据进行方差齐性检验，方差齐则用LSD法；方差不齐则用Dunnet’s T3法进行两两比较，P＜0.05为差异有显著性。
（二）结果
1.补肾软坚方药对小鼠血脂含量的影响 经高脂饲料喂养后，模型组、补肾软坚组和阿托伐他汀组与对照组ApoE-/-小鼠相比，血清TC、TG均明显升高，HDL-C明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，补肾软坚方药和阿托伐他汀均能降低ApoE-/-小鼠血清TC、TG（P＜0.01），升高HDL-C（P＜0.05）；与阿托伐他汀比较，补肾软坚方药升高HDL-C的作用稍强（P＞0.05）。（见表4-6）
表4-6 各组小鼠血脂的变化（mmol/L，x±s）
2.补肾软坚方药对小鼠主动脉组织MOVAT染色的影响 对照组小鼠主动脉根部结构相对完整，未见斑块形成，管壁富含弹力纤维。模型组ApoE-/-小鼠经高脂饲料喂养后，主动脉根部可见大量粥样斑块形成，粥样斑块区呈黄绿色，斑块内可见菱形胆固醇结晶，较多泡沫细胞沉积，且在斑块表层仅有少量纤维沉积。补肾软坚组小鼠主动脉根部亦可见粥样斑块形成及泡沫细胞沉积，但富含基质，且有较多棕黑色弹力纤维，斑块相对较小，也相对稳定。阿托伐他汀组小鼠主动脉根部有少量动脉粥样斑块形成，泡沫细胞沉积，但其管壁平滑肌增生较多，并有大量弹力纤维沉积，斑块较为稳定。（见附录，图4-26）
3.补肾软坚方药对小鼠主动脉组织病理炎细胞浸润的影响 对照组小鼠主动脉组织仅有少量炎细胞浸润；模型组、补肾软坚组和阿托伐他汀组小鼠主动脉组织可见大量炎细胞浸润，与对照组比较差异非常显著（P＜0.01）；经药物干预后，主动脉组织炎细胞浸润明显减少，与模型组比较差异非常显著（P＜0.01）。（见附录，图4-27，图 4-28）
4.补肾软坚方药对小鼠主动脉组织ADP及其受体蛋白表达的影响 第12周时，ApoE-/-小鼠与对照组比较，模型组、补肾软坚组和阿托伐他汀组小鼠主动脉组织处ADP浓度明显降低（P＜0.01）；经药物干预后，主动脉组织ADP浓度明显升高（P＜0.01）；两用药组比较差异不显著（P＞0.05）。而主动脉组织AdipoR1、AdipoR2的表达，不仅没有随着高脂喂养的时间延长而降低，与对照组比较反而呈升高趋势（P＜0.01）。与模型组比较，两用药组均能上调主动脉组织AdipoR1表达（P＜0.01）；其中，补肾软坚方药上调主动脉组织AdipoR1表达的能力较强（P＜0.05）。与补肾软坚组比较，阿托伐他汀上调主动脉组织AdipoR2的能力较弱（P＜0.01）。高脂饲料喂养后，模型组主动脉组织T-cadherin表达下降（P＜0.01），用药组表达上升（补肾软坚组P＜0.01，阿托伐他汀组P＜0.05）。（见图4-29，附录图4-30）
图4-29 补肾软坚方药对小鼠主动脉组织ADP及其受体蛋白表达的影响
注：C为对照组，M为模型组，BSKS为补肾软坚组，AT为阿托伐他汀组。
5.补肾软坚方药对小鼠主动脉组织TLR4、NF-κB蛋白表达的影响 与对照组比较，第12周时模型组、补肾软坚组和阿托伐他汀组主动脉组织TLR4、NF-κB蛋白表达量均有不同程度升高，差异具有显著性。与模型组比较，两用药组均能降低主动脉组织TLR4（P＜0.05）、NF-κB（P＜0.01）的蛋白表达。（见图4-31，附录图4-32）
图4-31 补肾软坚方药对小鼠主动脉组织TLR4、NF-κB蛋白表达的影响
注：C为对照组，M为模型组，BSKS为补肾软坚组，AT为阿托伐他汀组。
6.补肾软坚方药对小鼠血清VCAM-1表达的影响 与对照组比较，第12周时模型组、补肾软坚组和阿托伐他汀组ApoE-/-小鼠血清VCAM-1明显升高（P＜0.01）；经药物干预后，小鼠血清VCAM-1明显降低（P＜0.01）；补肾软坚方药降低血清VCAM-1浓度的能力稍弱（P＜0.05）。
图4-33 补肾软坚方药对小鼠血清VCAM-1表达的影响
注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与阿托伐他汀组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
（三）讨论
五脏六腑为一个有机整体，生理状态下相互滋养、制约，病理状态下彼此影响，相互危害，终致多脏受累。阮士怡教授治疗心血管疾病倡导治心不拘于心，五脏并重。“肾为先天之本，脾为后天之源”，补肾健脾，调控机体整体代谢机能。
根据中医理论，“恬淡虚无，真气从之，精神内守，病安从来”，倡导扶正以祛邪，“补肾健脾，软坚散结”，是扶正与祛邪的结合。动脉粥样硬化区炎细胞浸润是病理产物，也是导致AS病变发展的致病因子，脂联素是脂肪组织分泌的一种具有抗炎、抗氧化应激、增强胰岛素敏感性、抗动脉粥样硬化作用的保护因子，是机体正气的体现。低脂联素血症是心血管病的独立危险因素。本实验研究结果显示，补肾软坚方药可上调主动脉组织脂联素及脂联素受体表达，抑制TLR4/NF-κB/VCAM-1炎症通路，减少炎细胞黏附、聚集，是基于整体观念辨治心血管疾病的体现，亦是扶正以祛邪的体现。