补肾软坚方药对实验性动脉粥样硬化家兔NF-κ B及炎症因子的影响
对AS病理机制的认识，Ross于1999年在内皮损伤反应学说基础上提出的“AS是一种炎症性疾病”已被广泛接受。其中，调控炎症反应作用的重要信号通路细胞核因子-κB（NF-κB）及炎症细胞因子高表达在AS的发生发展过程中起了非常重要的作用。NF-κB转录到细胞核后，调节肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等一些细胞因子及炎症介质的转录过程，而这些细胞因子及炎症介质均可影响动脉粥样斑块的发展及其稳定性。说明NF-κB和炎症因子在AS的发生发展过程中具有重要作用。多年来我们于临床上运用补肾软坚方药治疗冠心病效果肯定，既往有研究显示补肾软坚方药具有降低血液黏度和减少血浆纤维蛋白原的作用。本研究将从对NF-κB和炎症因子调控角度入手，探讨补肾软坚方药对AS的干预机制。
（一）材料与方法
1.实验动物 普通级雄性日本大耳白兔36只，体重（2.2±0.2）kg。
2.试剂与药品 补肾软坚方药，辛伐他汀。血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒，NF-κB免疫组化试剂盒，MCP-1、IL-1、TNF-αELISA试剂盒。
3.方法
（1）造模 同第三章第一节。
（2）分组给药 实验动物随机分为正常对照组6只，模型组10只，补肾软坚组10只，辛伐他汀组10只（以下简称为正常组、模型组、补肾组和辛伐组）。辛伐组予辛伐他汀5mg/kg，每天1次；补肾组予补肾软坚方药1g/kg，每天2次。
（3）取材 同第三章第一节。
4.标本检测项目
（1）血脂指标检测 采用全自动生化分析仪测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。TG、TC采用酶比色法，LDL-C、HDL-C采用清除法，应用半自动生化分析仪测定。
（2）ELISA方法检测MCP-1、IL-1、TNF-α 严格按照说明书步骤进行。
（3）一般形态学观察 主动脉行苏丹Ⅲ染色，分析斑块面积占内膜面积的百分比；常规脱水包埋，切片厚5μm，行HE染色，光镜下观察。HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统测量血管内膜厚度（IT）、内膜中膜厚度比（IT/MT）及内膜增生指数（IHI）。
（4）免疫组化检测NF-κB阳性表达 石蜡切片脱蜡至水，3%H202封闭，PBS洗3次，蒸馏水冲洗，PBS洗3次，微波枸橼酸热修复，滴加5%兔血清封闭液，室温45min，4℃过夜，滴加一抗NF-κBP65，4℃ 20min，加二抗37℃孵育，PBS洗涤3次，DAB显色，苏木素复染，脱水封片，显微镜观察。每只动物选取3张切片，每张切片随机观察5个不同的高倍镜视野（40×），计算阳性细胞（细胞内有黄褐色或棕黄色沉淀物）的面积占内膜面积的百分比，取其平均值。
5.统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，变量间采用Pearson相关分析方法，P＜0.05为差异有统计学意义。
（二）结果
1.血脂水平检测结果 与正常组比较，模型组与给药组TC、HDL-C、LDL-C均呈增长趋势（P＜0.05，P＜0.01）。模型组3周、10周，辛伐组3周、10周，补肾组3周TG与正常组同期比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。两给药组与模型组比较，辛伐组3周时TC、LDL-C水平明显低于模型组（P＜0.05）；补肾组6周时HDL-C水平高于模型组（P＜0.05）。（见表3-14）
表3-14 各组TC、TG、LDL-C、HDL-C比较（mmol/L，x±s）
2.MCP-1、IL-1及TNF-α比较 模型组及给药组予以造模因素干预后，随着时间的延长，血清中MCP-1、IL-1、TNF-α的含量呈增长趋势，三者均高于正常组（P＜0.01）。与正常组及模型组比较，辛伐组在3周时降低血清中MCP-1、IL-1水平（P＜0.01）；在6周时降低血清中IL-1、TNF-α水平（P＜0.01）；在10周时降低血清中MCP-1、IL-1、TNF-α水平（P＜0.01）。补肾组在3周时降低血清中MCP-1、IL-1水平（P＜0.01）；在6周时降低血清中IL-1水平（P＜0.01）；在10周时降低血清中MCP-1、IL-1、TNF-α水平（P＜0.01）。（见表3-15）
表3-15 各组炎症细胞因子水平比较（ng/L，x±s）
3.NF-κB阳性表达面积 正常组血管壁见少量NF-κB阳性表达，胞核内见少量不均匀的黄褐色沉淀物；模型组血管壁平滑肌细胞、内皮细胞的胞核有大量棕黄色阳性区域，在胞质内也有少量阳性表达；辛伐组和补肾组内皮细胞和平滑肌细胞有少量棕黄色阳性沉淀物。正常组NF-κB阳性染色面积与内膜面积比为0.012±0.006。模型组阳性染色面积与内膜面积比为0.162±0.046，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。辛伐组与补肾组阳性染色面积与内膜面积比分别为0.107±0.049、0.111±0.038，均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。两给药组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见附录，图3-18）
4.一般形态学检查 观察结果见正常组主动脉内皮细胞完整，单层紧贴内弹力板，中层平滑肌细胞排列整齐，呈长椭圆形。模型组主动脉见有典型粥样斑块形成，斑块表面有纤维组织覆盖，形成典型的“纤维帽”，且纤维帽较薄；内膜明显增厚，内皮部分脱落、不完整，内皮下见脂质浸润，大量泡沫细胞及炎性细胞浸润，中膜平滑肌增殖并迁移于内膜，弹力板不连续，弹力纤维断裂溶解，有大量胶原纤维增生。辛伐组内膜增厚，有少量泡沫细胞形成，内皮完整，中膜平滑肌增殖，部分向内膜移行，弹力板尚完整。补肾组内膜增厚，可见若干泡沫细胞，内皮完整，中膜平滑肌增殖，排列尚规则，部分向内膜移行，弹力板尚完整。（见附录，图3-19）
5.各组IT、IT/MT、IHI及PA/IA比较 与正常组比较，模型组与两给药组IT、IT/MT、IHI、PA/IA数值明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，两给药组IT、IT/MT、IHI、PA/IA数值均降低（P＜0.05或P＜0.01）。两给药组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表3-16）
表3-16 各组IT、IT/MT、IHI及PA/IA比较（x±s）
6.各组血脂、炎症因子及IT/MT、IHI相关性比较 经Pearson相关性分析发现，模型组TC与IL-1、TNF-α与IHI呈正相关，相关系数分别为0.706（P＜0.05）和0.930（P＜0.05）。辛伐组TC与IL-1、TNF-α与IT/MT呈正相关，相关性系数分别为0.960（P＜0.01）和0.899（P＜0.05）。补肾组TC与IHI、IL-1与IHI、TNF-α与IHI、TNF-α与IL-1都呈正相关，相关性系数分别为0.917（P＜0.05）、0.876（P＜0.05）、0.829（P＜0.05）、0.858（P＜0.05）；血脂与炎症细胞因子之间无相关性（P＞0.05）。
（三）讨论
NF-κB是AS发生的始动机制之一，NF-κB激活后，参与AS发生的多种基因表达的调控，可调控许多炎症因子如TNF-α、IL-1等的转录过程，参与AS的病理过程。内源性MCP-1除趋化单核-巨噬细胞外，还能活化TNF-α，共同参与AS的发生、发展过程。
本研究通过建立兔AS模型也同样发现血清中MCP-1、TNF-α、IL-1水平增高，自第3~10周取材时血清中三者含量呈逐渐上升趋势；AS斑块内NF-κB活性增高，提示NF-κB、MCP-1、IL-1、TNF-α在AS发病过程中起着重要作用。本研究发现TC与IL-1呈正相关，TNF-α与IHI呈正相关，提示血中胆固醇含量增加与炎症反应加剧有一定关系；而炎症因子尤其是TNF-α水平增高可能会促进内膜增生。结果表明，补肾软坚方药具有升高HDL-C的作用。而辛伐他汀降低TC、LDL-C作用明显，第3周时即起效，而6~10周血脂水平仍低于模型组，但差异无统计学意义。可见，两者可能通过不同途径发挥调节血脂的作用。本实验结果显示，两种药均能降低血清炎症因子水平、抑制内膜增生以稳定AS斑块，其作用机制与抑制NF-κB的活性有关。NF-κB的不适当激活是引起炎症或氧化损伤的关键步骤，因而控制NF-κB的不适当激活是治疗AS的重要策略。由结果可以看出，两给药组对炎症水平的控制自第3周开始显效，至第10周效果最佳，对血清MCP-1、TNF-α、IL-1水平均有抑制作用，并抑制斑块内NF-κB的表达。同时，我们发现两药在作用环节和强度上有所差异，第6周时辛伐他汀对TNF-α的作用优于补肾软坚方药；而在第3、6周时补肾软坚方药对IL-1作用均优于辛伐他汀。进一步的相关性分析发现，补肾组TC、TNF-α、IL-1都与IHI呈正相关，提示补肾软坚方药对TC、TNF-α及IL-1水平的降低与抑制内膜增生之间有一定关系；而其对炎症反应的抑制作用与血脂水平无相关性，提示补肾软坚方药具有直接抑制炎症的作用，且不依赖于血脂水平，其抗炎作用可能是抑制AS斑块发展的机制之一。