禽流感的实验室诊断方法有哪些？
由于该病的症状变化较大且无典型性，所以确诊需要实验室方法进行，诊断方法主要包括病原学、血清学和分子生物学3部分。
（1）病原学的诊断方法 病毒的分离鉴定是禽流感的经典诊断方法，是检测病原的“黄金标准”。新建立的诊断方法成立与否均需要用该方法进行验证，但操作程序繁琐，费用高且耗时费力。另外，病毒在感染过程中的不同阶段、在不同的组织部位中的分布和含量存在差异，因此不能保证每次采样均能分离到病毒，从而易造成漏检。
①分离病毒以采集气管和泄殖腔拭子为最佳，采集死后的组织样品以气管、肺、脾及大肠为最佳。常采用9～11日龄无特定病原鸡胚或犬肾上皮连续细胞系进行禽流感病毒分离培养。若病料中有病毒，传代后的尿囊液具有红细胞凝集作用，若初次传代未检测到血凝活性，可将收获的鸡胚尿囊液盲传三代，若仍不出现血凝性，则可判定为阴性。有红细胞凝集作用的病毒要首先排除新城疫病毒后，再作进一步的鉴定。病毒分离鉴定方法周期较长。
②电镜检测技术。流感病毒为正黏病毒，属于形态特征性强的病毒，因而可用电镜技术或免疫电镜技术来诊断。临床采集的少量疑似病例肺组织，可用2.5%的戊二醛固定，制成超薄切片，透射电镜观察（X15000～X300000）。电镜下可见流感病毒粒子呈球形或丝状，球形病毒粒子直径在80～120nm，也可见囊膜及囊膜上的纤突。
电镜技术快速、准确，但检验结果与样品制备技术、病料的采集部位和时间有关，且本方法不能用于亚型及致病性的测定。免疫电镜技术可以用来分析病毒粒子的成分及含量，以及包装进病毒粒子的细胞成分。
（2）血清学诊断方法 主要是根据抗原和抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。现已有覆盖H1～H16和N1～N10的标准诊断及分型抗原和血清，并以此为基础，建立了多种禽流感抗原和抗体的检测方法。如琼脂扩散试验、血凝和血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验、病毒中和试验、免疫荧光试验、胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附试验等。已广泛应用于流行病学调查和免疫学研究以及疫苗免疫原性的评价等领域。这些诊断方法大多对试验条件要求较高，需要特定仪器，适用于实验室诊断，操作起来需要耗费一定的时间。
1）琼脂扩散试验。用于流感病毒亚型的检查。所有的禽流感病毒亚型都有型特异性的、共同的保守性抗原，可用一种禽流感病毒抗原或血清对所有A型禽流感病毒的抗体或抗原进行鉴定。
抗原由标准毒株或已知毒株制备，一般取绒毛尿囊膜经磨细、冻融等步骤提出病毒，再用0.1%～0.2%的甲醛灭活后36～48h制成。将已知抗原、待检抗原、待检血清、已知血清加入1%的琼脂板孔中，室温扩散24h。若用已知抗体检测待检抗原，当已知抗原和阳性血清之间出现沉淀线，待检抗原与阳性血清间出现沉淀线，并且沉淀线与邻近的阳性抗原和抗血清沉淀线相连，就可判定为阳性反应，即待检抗原为A型流感病毒。若用已知抗原检测待检血清中的抗体，出现沉淀线者为阳性。
2）对流免疫电泳技术。原理与琼脂扩散试验完全相同。将抗体加入琼脂板孔中，电泳1h，在阳性对照出现沉淀线，阴性对照不出现沉淀线的情况下，出现沉淀线者为阳性。
3）血凝和血凝抑制试验。
①血凝和血凝抑制试验可用以区别鸡新城疫病毒。
病料经磨细、冻融等步骤处理后，加入到鸡红细胞液中进行红细胞凝集试验。
病料或分离毒株胚液加抗鸡新城疫血清加红细胞，进行红细胞凝集试验。若鸡新城疫血清不能抑制病料或分离毒株胚液能凝集红细胞的特性，则可排除鸡新城疫感染。
②血凝抑制试验可确定分离病毒的血凝素和神经氨酸酶亚型。
“胚液”加“抗H1-H16血清”加“红细胞”，其中某一亚型血清能抑制病毒凝集红细胞，其血凝素即为那一亚型。
“胚液”加“抗N1-N10血清”加“红细胞”，其中某一亚型血清能抑制病毒凝集红细胞，其神经氨酸酶即为那一亚型。
③分子生物学诊断技术。因其具有特异性高、敏感性强、快速、对样品的要求不高等优点，已被大量应用于禽流感的快速诊断中，常用的有RT-PCR技术、RT-PCR-酶联免疫吸附法、实时RT-PCR检测技术、依赖核酸序列的扩增技术、异源双链体迁移率测定法、核酸探针技术、基因芯片技术等；其中，依据其原理和技术特点的差异，RT-PCR技术又分为常规、巢式、荧光、多元PCR和PCR- RFLP、荧光定量RT-PCR等。如设计禽流感病毒的HA基因和NA基因的简并引物进行RT-PCR，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，并与DNA分子标准DL2000比较，在0.8kb处有4条特异性条带则为阳性。
近年来禽流感病毒的检测手段已经得到非常大的改进和发展，已经开发出多种商品化的检测试剂盒。相信随着对禽流感病毒分子生物学知识更深入的认识，禽流感病毒的检测技术会不断涌现出更快速、更具有敏感性和特异性的方法。