蛋白质和氨基酸含量的测定
（一）半微量凯氏法（中华人民共和国国家标准，1982）
1.适应范围
本标准适用于测定谷类、豆类作物种子粗蛋白质含量。
2.仪器、设备
分析天平：感量0.0001g。
实验用粉碎机。
半微量凯氏蒸馏装置（推荐使用龙科-A型半微量蒸馏装置，也可用其他蒸馏装置）。
半微量滴定管：容积10mL。
硬质开氏烧瓶：容积25mL、50mL。
锥形瓶：容积150mL。
电炉：600W。
3.试剂
盐酸：分析纯，0.02 mol/L、0.05 mol/L标准溶液（邻苯二甲酸氢钾法标定）。
氢氧化钠：工业用或化学纯。40%溶液（质量分数）。
硼酸-指示剂混合液：
硼酸：分析纯，2%溶液。
混合指示剂：溴甲酚绿0.1 g、甲基红0.1 g分别溶于95%乙醇中，混合后稀释至100 mL，将混合指示剂与2%硼酸溶液按1∶100比例混合，用稀酸或稀碱调节pH为4.5，使呈炭紫色，即为硼酸-指示剂混合液。
注：此溶液放置时间不宜过长，需在1个月之内使用。
加速剂：五水合硫酸铜（分析纯）10g、硫酸钾（分析纯）100 g在研钵中研磨，仔细混匀，过40目筛。
浓硫酸：比重1.84，无氮。
双氧水：分析纯，30%。
双氧水、硫酸混合液（简称混液）：
双氧水、硫酸、水的比例为3∶2∶1，即在100 mL蒸馏水中，慢慢加入200 mL浓硫酸，待冷却后，将其加入300 mL 30%双氧水，混匀。
注：此混合液可一次配制500～1000 mL，贮藏于试剂瓶中备用。夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏，室温（20℃）时不必冷藏，贮藏时间不超过1个月。
蔗糖：分析纯。
4.样品的选取和制备
选取有代表性的种子（带壳种子需脱壳），挑拣干净，按四分法缩减取样，取样量不得少于20 g。
将种子放于60～65℃烘箱中干燥8h以上，用粉碎机磨碎，95%通过40目筛，装入磨口瓶中备用。
5.测定步骤
（1）称样：称取0.1 g试样两份（含氮1～7 mg），精确至0.0001 g，同时测定试样的水分含量。
（2）消煮1：将试样置于25 mL凯氏瓶中，加入加速剂粉末。除水稻种子为lg外，其他均为2g。然后加3 mL硫酸，轻轻摇动凯氏瓶，使试样被硫酸湿润，将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热，开始用小火，待泡沫停止后加大火力，保持凯氏瓶中的液体连续沸腾，沸酸在瓶颈中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时，谷类继续消煮30 min，豆类继续消煮60 min。
（3）消煮2：将试样置于50 mL凯氏瓶中，加入0.5 g加速剂和3 mL混合液，在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗，倾斜在电炉上加热，开始用小火（用调压器将电压控制在175V左右），保持瓶中液体呈微沸状态，5 min后加大火力（将电压控制在200V左右）。保持凯氏瓶中液体连续沸腾。消煮总时间：水稻、高粱为30 min，其他均为45 min。
注：消煮中列入两种消煮条件，经与国际谷物化学协会标准法（ICC）比较，t值测验均不显著，准确度与精密度也基本一致，在具体工作中可根据实际情况选其中一种。
（4）蒸馏：消煮液稍冷却后加少量蒸馏水，轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中，用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶4～5次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10 mL硼酸-指示剂混合液的锥形瓶中，向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15 mL（如采用消煮2的条件，加10 mL即可）。然后通气蒸馏，当蒸馏出液体积达50 mL时，降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1～2 min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均收集在锥形瓶中。
（5）滴定：谷类以0.02 mol/L，豆类以0.05 mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白：用0.1 g蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体积不得超过0.3 mL。
6.结果计算
式中 V2——滴定试样时消耗标准酸的体积，mL；
V1-——滴定空白时消耗标准酸的体积，mL；
N——标准酸溶液的当量浓度；
K——氮换算成粗蛋白质的系数；
W——试样质量，g；
X——试样水分含量；
0.0110——每毫克当量氮的质量（单位：g）。
平行测定的结果用算术平均值表示，保留到小数点后二位。
两份试样粗蛋白质的平行测定结果为15%以下时，其相对误差不得大于3%，平行测定结果为15%～30%时相对误差为2%，30%以上时为1%。
结果必须注明氮换算成粗蛋白质的系数，换算系数见表5.15。
表5.15 不同作物种子含氮量换算成粗蛋白质的系数K
（二）酚试剂法测定微量蛋白质含量
酚试剂法的特征是能够对2～100 μg蛋白质定量，而且操作简单，精密度较好。这一微量定氮法是劳里等1951年提出的改良法，至今仍是谷物品质及生化领域研究中用得最多的方法。本法也可以说是福林蛋白质定量法的灵敏性和双缩脲法的优点相结合的改良法，其灵敏度比双缩脲法高100倍。除蛋白质外，其他酚类化合物及一些还原性物质均有干扰作用，在待测样品中混有这些物质时，需要校正。粮油籽粒中（除高粱外）所含干扰物质较少，因而酚试剂法可用于粮油籽粒及植株体中微量蛋白质的测定。
1.方法原理
酚试剂主要由两部分组成。试剂A相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。试剂B中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸，故有此显色反应。颜色深浅与蛋白质浓度呈正比关系（在一定浓度范围内）。
2.仪器、设备
试管及试管架。
刻度吸管（1mL、5mL）。
光电比色计。
龙科-A型半微量定氮器（图5.5）
图5.5 龙科-A型半微量定氮器示意图
1—蒸汽发生器；2—定氮内室；3—定氮外室；4—进样杯；5—磨口玻璃塞；6—冷凝管；7—接水漏斗（防止冷凝管上空气冷凝水流入接收瓶）；8—氮接收瓶；9—废液排出口；10—加碱杯；11—进气口；12—排气口
3.试剂
酚试剂A：10g Na2CO3、3g NaOH和0.25 g酒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水中；另取0.5g CuSO4·5H2O溶于100 mL蒸馏水中。临用时，将前者50 mL与后者1 mL混合。
酚试剂B：50 g钨酸钠（Na2WO4·2H20）、12.5 g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及350 mL蒸馏水、25 mL 85%磷酸和50 mL浓盐酸，置于1 000 mL磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，在沸水浴中回流10h。冷却后，加入硫酸锂75 g、蒸馏水25 mL及1～2滴溴，开口沸腾15 min，驱除过量的溴。冷却，稀释至500 mL，过滤，滤液呈黄色，贮于棕色瓶中，临用时将试剂稀释至相当于1 mol/L酸（可用标准浓度NaOH标定后进行稀释）。此时的体积为原先的1.9～2倍。酚试剂B中的硫酸锂起防止酚试剂显色反应中不溶性钠盐沉淀或浑浊的作用。溴可氧化混在试剂中的还原性物质。
蛋白标准液：称取25 mg（用凯氏定氮测定）牛血清蛋白或酪蛋白，前者加蒸馏水溶解，定容至100 mL，后者加0.15 mol/L KOH溶液，加热溶解后定容至100 mL，即为250 μg/mL蛋白质标准液。
4.测定步骤
（1）标准曲线制备：
取7只试管，分别加入蛋白质标准液（250 μg/mL）0、0.15、0.30、0.60、0.75、1.00 mL，均加蒸馏水至1.00 mL。按顺序向管中加4 mL酚试剂A，混匀，在室温下放置10 min后再加酚试剂B 0.5 mL，立即混匀，经过30 min之后，在波长650 nm下测定光密度，以蛋白质质量（单位：μg）为横坐标，相应的光密度值为纵坐标制作蛋白质标准曲线。
（2）样品中蛋白质测定：
样品烘干粉碎，过40目筛，谷物取0.1 g、豆类0.05 g、植株体0.1 g，加一定溶剂：谷物加0.2%氢氧化钠，大豆、花生等用10%氯化钠溶液，在玻璃研钵中研磨提取蛋白质，并稀释至一定体积。准确吸取样品液1 mL，加酚试剂A4 mL，混匀，在室温下放置10 min，再加酚试剂B 0.5 mL，混匀，30 min后，在比色计上测定其光密度。对照标准曲线求出样品液中蛋白质质量。
5.结果计算
式中 Y——100 g样品中蛋白质含量，g；
X——由标准曲线查得样品测定液中蛋白质含量，μg；
V——样品蛋白质提取液总体积，mL；
W——样品质量，g；
1——比色时所用样品液体积，mL；
100——换算为100 g样品中蛋白质含量换算系数；
10-6——μg换算为g的换算系数。
附注：
（1）由于Lowry原法中硫酸铜的酒石酸钾钠溶液放置后会出现沉淀物，且不易重新溶解，故已将酒石酸钾钠按原比例配制在酚试剂A第一部分溶液中。
（2）浓密较低的下列物质对显色没有影响：尿素（0.5%左右）、胍（0.5%左右）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯醋酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、丙酮（0.5%）；上述物质浓度高时必须做校正曲线。若样品液酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠-氢氧化钠的浓度1～2倍。样品中含酚类、柠檬酸、糖和甘油等都有干扰作用。
（3）本法可测范围为：蛋白质浓度25～250 μg/mL，一般用72型分光光度计，可选用波长650 nm或660 nm，若蛋白质浓度在20～100 μg/mL，也可选用750 nm，125 μg以上则采用550 nm。在660 nm处测的光密度为750 nm时的90%。
（三）染料结合法测定蛋白质含量
Udy（1956）首次提出染料结合法（DBC法）测定蛋白质含量，方法简单、快速、重现性好，特别是经过一系列改进和国内研制成功G×D-201型蛋白质分析仪后，这一分析技术已广泛应用于谷物、油料籽粒的品质分析和育种材料的筛选工作。
1.方法原理
在酸性条件下，样品蛋白质中的组氨酸、精氨酸和赖氨酸残基与偶氮磺酸染料如酸性橙（AO-12，一种单磺酸盐）发生静电结合，形成不溶性的复合物。加入过量的偶氮磺酸染料，反应按下式进行：
蛋白质+染料（过量）←→蛋白质-染料配合物+染料（多余）
蛋白质含量与染料结合量之间存在正相关关系，先对20个左右蛋白质含量不等的样品用凯氏法测得蛋白质百分含量，再由染料结合法测定相应样品来结合的染料溶液透光率，对二者进行数理统计，求出回归方程。
2.仪器、设备
G×D-201型蛋白质分析仪（或72型光电比色计）。
离心机（4000 r/min）。
分析天平（感量0.0001g或0.001g）
振荡器。
有塞试管。
离心管。
刻度吸管。
3.试剂
（1）磷酸缓冲液：3.4 g磷酸二氢钾、20 g草酸加蒸馏水溶解后，再加1.7 mL 85%磷酸（H3PO4）、60 mL冰醋酸、1 mL丙酸，稀释至1 000 mL。
（2）酸性橙-12（相对分子质量为350.37）染料溶液：用磷酸盐缓冲液加热溶解酸性橙-12，配制成浓度为3.89 mmol/L的溶液。
（3）半饱和醋酸钠溶液：先配成饱和醋酸钠溶液，称取75 g无水醋酸钠于100 mL蒸馏水中，加热溶解，冷却，静置过夜。过滤得醋酸钠饱和溶液，再以蒸馏水稀释一倍即为半饱和醋酸钠溶液。
注：近来也有研究提出以16%醋酸钠液代替。
4.测定步骤
（1）回归方程式的求得：选取蛋白质含量高低不等的样品，粉碎，过40目筛，按凯氏定氮法测定蛋白质含量。再称取相应的样品，均为0.5000g，放入有塞试管中，加2 mL半饱和醋酸钠溶液及20 mL酸性橙-12染料溶液，盖上塞子，置振荡器上，在室温下振荡1h。反应液以4000 r/min离心10 min，然后在蛋白质分析仪上测定上清液（即剩余染料溶液）的透光率。或者将上清液再稀释50倍，在72型光电比色计上，于482 nm下测定溶液的透光率（或光密度）。根据20个左右样品凯氏法测得的蛋白质含量及同一批样品染料结合法（剩余染料溶液）测定的透光率进行数理统计，算出回归方程。
（2）样品中蛋白质含量测定：取粉碎后过40目筛的样品0.5000g，按上述操作加半饱和醋酸钠溶液、染料溶液，振荡，离心，在同样的蛋白质分析仪上测定剩余染料溶液透光率或将上清液稀释50倍后，在同一72型光电比色计上测定透光率（或光密度）。
5.结果计算
将待测样品的透光率代入回归方程式中，即可算出样品中蛋白质含量。
（四）考马斯亮蓝G-250快速测定蛋白质含量
近年来，Bradford（1976）应用考马斯亮蓝G-250（Coo-massie Brilliant Blue G-250）与蛋白质束缚时产生的颜色反应进行蛋白质含量测定。蛋白质与色素结合在2 min左右的时间内达到平衡，在室温下1h内保持着稳定的分散状态。因而此法快速、操作方便、再现性好，测定范围1～1000μg。间苯二酚、酪氨酸及色氨酸等对考马斯亮蓝G-250的蛋白质测定没有干扰。
1.方法原理
考马斯亮蓝G-250具有下列变化性质：在游离状态下呈红色，但一经和蛋白质结合就变为蓝色（青色）。溶液的吸收光谱发生变化，从465 nm转到595 nm（图5.6），并且表现出在595 nm处的吸收值与溶液中蛋白质含量有线性关系。可用牛血清蛋白作标准进行比色测定样品中蛋白质含量。
图5.6 考马斯亮蓝G-250蛋白束缚时溶液吸收光谱的偏转变化
2.仪器、设备
分析天平（感量0.0001g）。
72型分光光度计。
有塞试管（10mL）。
刻度吸管（1 mL、10 mL）。
恒温水浴锅。
容量瓶（50mL）。
3.试剂
（1）蛋白质标准溶液：称取牛血清蛋白（用凯氏法定氮测定含量）100 mg，溶于100 mL蒸馏水中，混匀。吸取此液5 mL，加蒸馏水稀释至50 mL，即为100 μg/mL牛血清蛋白质标准液。
（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 95%乙醇中，加入85%（质量分数）磷酸100 mL，最后加蒸馏水到1000 mL，混匀。此溶液在常温下可放置1个月。
（3）0.25%氢氧化钠溶液。
4.测定步骤
（1）蛋白标准曲线的制备：吸取牛血清蛋白标准液（100μg/mL）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL分别放在10 mL有塞试管中，均加蒸馏水至1 mL，再加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，将试管混匀，室温下放置2 min后，在595 nm下，用1 cm比色杯测定溶液光密度值，以光密度值为纵坐标、牛血清蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样品中蛋白质的提取：谷物或植株样品烘干、粉碎，在分析天平上称取一定量样品（谷物0.05 g，植株体0.1 g）放入50 mL容量瓶中，加0.25%氢氧化钠溶液5 mL，在室温下放置过夜，或在40℃下振荡提取30 min，以蒸馏水定容至刻度，混匀，静置，即为样品中蛋白提取液。
（3）样品中蛋白质含量的测定：取样品液1 mL（尽量不要吸有杂质残留物），加考马斯亮蓝G-250溶液5 mL，混匀，在室温下静置2 min，如同制标准曲线操作进行比色测定样品液中光密度值，查标准曲线即可算出样品中蛋白质含量。
5.结果计算
式中 A——样品测定液中蛋白质质量，μg；
W——样品质量，g；
1——测定液体积，mL；
50——样品液总体积，mL；
10-6——克换算为微克的系数；
100——换算为百分含量。
附注：
（1）染料强度随温度升高或作用时间的延长而加强，低温下有利于固定。溶液颜色避光保存至少可稳定12 h。
（2）大多数物质对测定没有干扰，如脲（5mol/L）、氯化钠（2mol/L）、Tris-HCl（0.1mol/L）、二硫苏糖醇（0.001mol/L）、硫酸钠（0.01mol/L）、甘油（30%）、硫酸铵（0.3mol/L）、氯化镁（0.1mol/L）、氯化钾（2mol/L）、磷酸氢二钠（0.3mol/L）、Triton-100（1%），核酸也无干扰。但1%十二烷基磺酸钠（SDS）可使显色程度减弱50%以上，1%脱氧胆酸钠和1%十二烷基肌氨酸钠破坏线性关系。
（五）改良的双缩脲法快速测定蛋白质含量
双缩脲法具有简便、快速、专一性强的特点。蛋白质的种类对显色没有明显影响，组氨酸以外的游离氨基酸和二肽化合物均不能显色。双缩脲、1-亚氨基缩脲、2-亚氨基缩脲、丙二酰胺、氨基酰胺等少数化合物外的非蛋白质化合物也不显色。近年来，不断改进双缩脲试剂，在碱性酒石酸铜双缩脲试剂中，加入等体积的异丙醇，生成一种稳定的溶液，它迅速地与蛋白质反应并且易于过滤，对于富含淀粉的谷物样品，不需要提取蛋白质而直接进行测定。同时将双缩脲反应温度升到60～65℃，5 min显色完全。
1.方法原理
蛋白质含有2个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色配合物，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸成分无关。显色反应受温度影响很大（图5.7），在常温（20～25℃）下需1 h，40℃需15 min，60℃需5 min。
图5.7 不同温度下双缩脲显色稳定曲线
2.仪器、设备
光电比色计。(https://www.daowen.com)
离心机（4000r/min）。
分析天平（感量0.0001g或0.001g）
恒温振荡器或恒温水浴锅。
离心管、刻度吸管。
3.试剂
4%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液。
2.5%酒石酸钾钠溶液。
5 mol/L氢氧化钾溶液。
异丙醇。
双缩脲试剂：在500 mL容量瓶中，依次加入4% CuSO4·5 H2O 30 mL和2.5%酒石酸钾钠100mL，再慢慢加入5mol/LKOH 30mL，最后用蒸馏水稀释至刻度。使用时，再将上述溶液与透明度良好的异丙醇等体积混合。
4.测定步骤
（1）酪蛋白标准曲线的绘制：称取国产酪蛋白质2g（磨细至80目）于0.15mol/LKOH溶液中，加热溶解并定容至100 mL，分别取此溶液0.2～0.9mL 8份，加入10mL双缩脲试剂，在60℃的恒温水浴振荡器中振荡5 min，随后以4 000 r/min离心10 min，取离心液在波长550 nm下，以1 cm比色杯进行比色测定，空白为不加酪蛋白的试剂。同时取此溶液5 mL（双样）进行凯氏定氮，乘以换算系数6.41即为酪蛋白含量。根据测得的光密度值与相应酪蛋白含量进行回归，算出回归方程式y=a+bx（x为酪蛋白光密度，y为相应酪蛋白含量）。
（2）样品处理与测定：样品粉碎、磨细，通过40目筛，以风干样品或烘干样品测定蛋白质含量。在分析天平上准确称取待测样品0.1000 g，放入干燥的25 mL凯氏消化瓶或大试管中，内放几粒玻璃珠，加入10 mL双缩脲试剂，在60℃的恒温水浴振荡器上振荡5 min，随后以4000 r/min离心10 min，取离心液在波长550 nm下，以1 cm比色杯进行比色测定，空白为不加样品的试剂溶液。
5.结果计算
将样品测得的光密度值代入酪蛋白回归方程y=a+bx（其中x表示样品光密度值，y代表样品蛋白质含量）。再乘稀释倍数1000，即为100 g样品中蛋白质含量（g）。
附注：
（1）对含脂肪高的样品溶液与双缩脲试剂混合后，若有雾状沉淀，需让其静置2h以上，再离心，取其清液比色。
（2）异丙醇可降低淀粉的溶解性，有利于蛋白质提取及显色。
（六）小麦育种中蛋白质单粒筛选技术
利用三硝基苯磺酸（TNBS）染色法测定籽粒蛋白质含量的方法简单、快速，只需10～20粒种子就能测出蛋白质的含量，而且不破坏种子的发芽力，是小麦高蛋白育种的一种适用的方法，减少了盲目机遇性，大大提高了小麦高蛋白育种成功的概率。
1.方法原理
三硝基苯磺酸能同蛋白质中N末端的α-氨基及赖氨酸残基ε-氨基反应生成橘红色的三硝基苯化蛋白质：
在小麦蛋白质中，谷蛋白是其主要组分，赖氨酸残基ε-氨基在蛋白质分子中所占的比例远比N末端的α-氨基多，故在三硝基苯磺酸同蛋白质发生染色反应中ε-氨基起着主要作用。从表5.16可以看出，赖氨酸在组成蛋白质中有一定的比例，大约是3%，故赖氨酸含量的多少基本上可以反映蛋白质含量的高低。因此蛋白质含量越高，N末端的α-氨基和赖氨酸残基ε-氨基也越多，用三硝基苯磺酸染色越深；反之，蛋白质含量越低，N末端的α-氨基和赖氨酸残基ε-氨基也越少，用三硝基苯磺酸染色越浅。
根据上述原理，先将已知蛋白质含量为高、中、低的6个水稻品种的籽粒切断，浸泡在三硝基苯磺酸试剂中染色观察，结果表明染色的深浅和蛋白质含量的高低是吻合的，蛋白质含量高，染色深，蛋白质含量低则染色浅。
表5.16 糙米中赖氨酸含量与蛋白质含量的相互关系（含水量12%）
2.测定步骤
（1）试剂的配制：先用1g三硝基苯磺酸加水100 mL，配成1%的溶液。另用40 g碳酸氢钠加水1000 mL，配成4%的溶液。使用时再用1份三硝基苯磺酸溶液同10份碳酸氢钠溶液混合即成使用试剂，配好的试剂最好在3d之内用完，放置太久就会失效。
（2）设置对照品种：此法必须设置对照品种作为比色的标准，因此应选择有代表性的一个高蛋白品种、中蛋白品种及一个低蛋白品种作为对照。
（3）籽粒的准备：每10个材料为一批，每批都要加对照品种，种子袋上按小玻璃管上的号数编号，对照品种和每个材料各取10～20粒（一般品种取10粒，杂种后代取20粒）正常成熟的种子，用单面刀片离顶端约1/4处横切下去，切面要平整，留下有胚的部分，放入编号相同的小玻璃管中即成。如果是红米或紫米，果皮颜色会严重影响显色，因此应先剥去谷壳，刮去顶部的果皮，然后再切断供染色之用。在此种情况下，对照品种也应如此处理。
（4）染色处理：用橡皮头吸管吸取三硝基苯磺酸试剂约2 mL放入小玻璃试管中，待12支小试管都放了试剂后，逐一摇动几下，使谷粒全部沉入试剂之中，然后放入40℃的温箱中进行反应染色。由于新配试剂反应染色较快，而陈旧试剂反应染色较慢，所以反应染色时间一般需3～5h，以高蛋白对照品种的籽粒染成橘红色为准，反应染色的温度不要超过40℃，使种子发芽力不受影响，以便进行高蛋白单粒选择。如果没有温箱，室温下反应染色也可，但所需反应时间要长得多。
（5）清洗与比色：反应染色完毕，即将管中溶液倒掉，用清水冲洗2次，把水倒掉。比色时要注意保持籽粒切面有相同的湿润状态，不能让其干燥而部分变白影响比色。先将高蛋白和低蛋白对照籽粒分别插入比色板两侧的小孔中，接着将供测材料逐一放入比色板中间的小孔中，用10倍以下的放大镜观察与对照进行比色，蛋白质含量分高、中、低三个标准，9%以下为低蛋白，9%～11%为中蛋白，12%以上为高蛋白，根据颜色的深浅就可估计出蛋白质含量的范围。
附注：
（1）本法不破坏种子的发芽力。经三硝基苯磺酸试剂反应染色后的种子发芽率为96.2%，切口用丙酮溶解赛璐珞封口后播种，能正常成苗。
（2）在用三硝基苯磺酸染色法测定蛋白质含量时，可鉴定出同一品种内或一个杂交种单株上的籽粒之间蛋白质含量的差异，一般相差1%～3%。据此可进行高蛋白单粒的筛选工作。
（七）茚三酮法快速测定赖氨酸含量
穆西柯等根据玉米的各个蛋白质组分与茚三酮的反应，提出了不需要预先水解蛋白质，在一定条件下赖氨酸的ε-氨基与茚三酮反应形成有色配合物，通过比色测定赖氨酸含量。此法简便，不需要复杂仪器设备，适合筛选大量样品的赖氨酸含量测定，有着广泛的应用价值。
1.方法原理
粮油籽粒蛋白质分子中的赖氨酸残基ε-氨基与茚三酮试剂反应，生成紫红色物质，在515～525 nm下比色，可作赖氨酸的定量测定。该法用碳原子数与赖氨酸相同的亮氨酸溶液为标准溶液。由于亮氮酸有一个氨基相当于蛋白质上赖氨酸的ε-氨基，故用亮氨酸标准液制备标准曲线来测定蛋白质中赖氨酸的含量。
2.仪器、设备
72型分光光度计或581G型光电比色计。
恒温水浴锅。
温度计（0～100℃）。
试管（20mm×180 mm）。
3.试剂
（1）缓冲液：称取30 g甲酸钠，溶于约60 mL水中，加入10 mL 88%的甲酸，最后用蒸馏水定容至100 mL。
（2）茚三酮试剂：称取1g茚三酮和2g氯化镉放入棕色瓶中，加25 mL上述缓冲液和75 mL乙二醇，室温下放置1d后才能使用，若出现沉淀则须过滤。该试剂在常温下至多使用2 d。
（3）4%和2%碳酸钠溶液各100 mL。
（4）标准亮氨酸溶液：准确称取25 mg亮氨酸，加数滴稀盐酸，待溶解后，用蒸馏水定容至50 mL，浓度为500 μg/mL。再分别吸取2、4、6、8、10、12 mL上述母液，于25 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。
4.测定步骤
（1）标准曲线的制备：准确吸取已配好的标准亮氨酸溶液各0.5 mL，分别放入6支试管中，另取1支试管加入0.5 mL蒸馏水作为空白。每支试管各加入0.5 mL 4% Na2CO3溶液及2 mL 茚三酮试剂，混匀，在80℃水浴中保温30 min。取出，放入冷水中冷却3 min，然后，每支试管各加10 mL 1∶1的95%乙醇，摇匀。在515 nm下（或用绿色滤光片）进行比色。以空白作对照，读取光密度值，绘制标准曲线。
（2）样品的测定：准确称取风干、磨细、通过60目筛的样品（油料种子须经脱脂）25 mg放入250 mg石英砂及1 mL 2%的碳酸钠中，用圆头玻璃棒充分搅拌，研磨2 min。移至试管，然后放入80℃恒温水浴中提取10 min。取出试管，各管依次加入2mL茚三酮试剂，摇匀，在80℃水浴中保温30 min。显色后取出，放入冷水中冷却3 min，每管各加10 mL 47.5%乙醇，过滤，在515 nm下（或用绿色滤光片）进行比色，读取光密度值，记录。在相同条件下以不加样品的空白作对照。
5.结果计算
由亮氨酸标准曲线查得的值代入下式，求出赖氨酸的含量。
式中 L——由曲线查得亮氨酸的质量，μg；
W——样品质量，g；
1.11——由赖氨酸与亮氨酸相对分子质量之比求出的换算系数；
A——样品中的游离氨基态氮的量；
主要谷物中游离氨基态氮的量A为
小麦——0.05% 水稻——0.01%
高粱——0.04% 玉米——0.1%
100——换算为百分含量；
106——克换算为微克的系数。
（八）2-氯-3，5-二硝基吡啶法测定赖氨酸含量
赖氨酸的测定方法很多，各有其优缺点。国内外采用2-氯-3，5-二硝基吡啶作为发色团试剂测定赖氨酸含量。此法准确、稳定性能好，重现性强；但试剂有毒，价格昂贵，而且操作较繁琐。
1.方法原理
赖氨酸和铜盐定量反应，生成可溶性铜配合物，此配合物在碱性缓冲溶液中，再与2-氯-3，5-二硝基吡啶试剂反应生成黄色化合物。在一定浓度范围内，赖氮酸含量与溶液黄色深浅呈正比关系。
2.仪器，设备
分析天平（感量0.0001g）；
离心机（4000 r/min）；
721分光光度计；
保温箱；
具塞刻度试管（10mL）；
刻度吸管（1 mL、5 mL）；
3.试剂
（1）磷酸铜悬浮液：称1.4 g分析纯氯化铜（CuCl2·2H2O），用蒸馏水溶解后定容至50 mL。另称取6.8 g分析纯磷酸钠（Na3PO4·12H2O），用蒸馏水溶解后定容至100 mL。将上述两种溶液混合均匀后，以3000 r/min离心15 min，倾去上清液，沉淀物以0.05 mol/L硼酸钠缓冲液洗涤再离心，重复3次。将沉淀物悬浮于40 mL硼酸钠缓冲液中。贮存在冰箱中，最多能用2周。
（2）0.03 mol/L磷酸钠缓冲液（pH=7.4）。
（3）木瓜酶A液（标准曲线用）：称取500 mg木瓜酶，以0.03 mol/L磷酸钠溶解后定容至100 mL，摇匀，过滤备用。
木瓜酶B液（样本测定用）：称400 mg木瓜酶，用0.03 mol/L磷酸钠溶解后定容至100 mL，摇匀，过滤备用。
（4）0.05 mol/L硼酸钠缓冲液（pH=9）。
（5）0.05 mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH=9）。
（6）显色液：称取300 mg 2-氯-3，5-二硝基吡啶，以甲醇溶解并定容至10 mL备用（用时新配）。
（7）1.2 mol/L盐酸。
（8）99.5%醋酸乙酯。
（9）正己烷。
（10）混合氨基酸溶液：胱氨酸20 mg、甲硫氨酸20 mg、组氨酸30 mg、丙氨酸30 mg、异亮氨酸30 mg、苏氨酸30 mg、酪氨酸30 mg、甘氨酸40 mg、苯丙氨酸40 mg、缬氨酸40 mg、精氨酸50 mg、丝氨酸50 mg、天门冬氨酸60 mg、谷氨酸300 mg、亮氨酸80 mg、脯氨酸80 mg。把上述16种氨基酸混匀后，称取100 mg氨基酸混合物，溶解在10 mL碳酸盐缓冲液中。
（11）赖氨酸标准原液：2500 μg/mL。
4.测定步骤
（1）标准曲线绘制：取赖氨酸标准原液0、2、4、6、8、10 mL，分别放入6个10 mL容量瓶中，以碳酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即分别为0、500、1000、1500、2000、2500 μg/mL赖氨酸标准液。分别取上述标准液各1 mL，放入6个10 mL刻度试管中，加入4 mL木瓜酶A液，加塞摇匀。再分别取各管中酶解液1 mL放入另外6个10 mL刻度试管中，加入0.5 mL氨基酸混合液及0.5 mL磷酸铜悬浮液，加塞振荡5 min，然后以3000 r/min离心10 min。分别取离心后上清液1 mL，放入10 mL试管中，加入0.1 mL 2-氯-3，5-二硝基吡啶溶液，充分振荡。室温下放置2h，每30 min振摇一次。向各管加入5 mL 1.2 mol/L盐酸，充分振摇进行酸化，再加入5 mL醋酸乙酯，加盖颠倒15次，进行提纯去杂（以头上带有聚乙烯管的注射器去掉上层醋酸乙酯有机相，用分液漏斗也可，重复3次）。最后取水相在波长390 nm处进行比色。此显色液浓度各为0、10、20、30、40、50 μg/mL。然后以光密度为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样本测定：称取用正己烷脱脂的样本0.1～0.4 g（视赖氨酸含量多少而定），放入10 mL刻度试管中，加5 mL木瓜酶B液，使样本湿润，加塞振摇3 min。放入65℃保温箱中转化1h，每隔20 min振摇一次。再将离心管连同样本放在65℃保温箱中过夜，次日取出冷却至室温，离心。再取离心后上清液1 mL放入10 mL刻度试管中，加0.5 mL碳酸盐缓冲液及0.5 mL磷酸铜悬浮液，振荡5 min，离心。取离心后上清液1 mL放入10 mL试管中，加0.1 mL 2-氯-3，5-二硝基吡啶，充分振摇，室温下放置2h，每30 min振摇一次。加入5 mL 1.2 mol/L盐酸充分振摇，以下步骤同标准曲线，比色后从曲线上查得赖氨酸质量（μg），减去空自，然后计算出样品中赖氨酸含量。
5.结果计算
式中 A——查标准曲线得每毫升样品液中赖氨酸质量，μg；
W—样品质量，g。
（九）三硝基苯磺酸法测定氨基酸及赖氨酸含量
三硝基苯磺酸（TNBS）除用于谷物蛋白质中赖氨酸的定量测定外，也是定量测定氨基酸的重要试剂。它与茚三酮反应具有相当的灵敏度，且操作简便，无需添加有机溶剂或特殊处理，也不易受游离氨、尿素等外界因素的干扰。加入适量的
-可使灵敏度提高一倍以上。
1.方法原理
三硝基苯磺酸（TNBS）在偏碱性条件下与氨基酸反应，先形成中间配合物（带等摩尔
），如下所示：
中间配合物在光谱上有2个吸收值相近的高峰，分别位于355 nm和420 nm附近。然而溶液一旦酸化，中间配合物转化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420 nm处的吸收值显著下降，而355 nm附近的吸收峰移至340 nm处。
利用TNBS与氨基酸反应的这一特性，可在420 nm处（偏碱性溶液中）或在340 nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。表5.17列出各种氨基酸与TNBS反应后在不同条件下测定的光密度值。在340 nm处，各氮基酸吸收值大致相近，而在420 nm处吸收值因氨基酸种类而异，加入适量
，吸收值升高。TNBS与氨基酸中氨基的反应取决于溶液的pH、温度及氨基酸的性质。当pH低于6.2时几乎不起反应，随pH升高，反应速度加快，pH大于11时，反应迅速，在2～3 min内即完全；但TNBS本身的破坏也加强，空白提高，因而一般取pH 9～10为宜。通常用NaHCO3溶液，最终浓度为1%较理想。TNBS与不同性质氨基酸反应速度不同，与碱性氨基酸的反应较快，在40℃时30 min内反应即完成。保温2h各种氨基酸反应均可完成。
表5.17 各种氨基酸与TNBS反应后在不同条件下测定的光密度值
续表5.17
注释：
①取不同含量氨基酸液1mL，加4% NaHCO31 mL、0.1% TNBS1mL，于40℃反应2h，用水补充至4 mL，在420 nm处测定。制作氨基酸浓度-OD420坐标图，从曲线中求得各氨基酸于1μmol时的光密度。
②条件同上，但在与TNBS反应时加0.01% Na2SO31 mL，最后总体积也是4mL，同样在420nm处测定。
③条件同①，但与TNBS反应后加1mol/L HCl1mL酸化，在340nm处测定。
测定蛋白质中赖氨酸基于TNBS只与蛋白质N末端的α-氨基及赖氨酸残基的ε-氨基反应，反应后生成的TNP-蛋白质经盐酸水解后分别产生含有α-TNP-氨基及ε-TNP-氨基的小肽碎片。在酸性溶液中前者可用有机溶剂抽提除去，而酸性液中留下的ε-TNP-氨基含量即可在340 nm处定量测定，此含量即相当于蛋白质中赖氨酸的含量。
在酸解时，为了避免TNBS本身被破坏，水解时间不宜过长，一般110℃下2h即可。—SH的干扰作用可将蛋白质在碱性条件下保温数小时变形，即可使蛋白质全部氨基暴露，同时在此条件下—SH氧化成二硫键。
2.仪器、设备
分析天平（感量0.0001g）；
紫外分光光度计；
试管（10 mL）；
移液管（1 mL）
容量瓶（50 mL）。
3.试剂
（1）0.1%三硝基苯磺酸溶液：称取0.1 g三硝基苯磺酸加蒸馏水定容至100 mL；
（2）4%碳酸氢钠溶液（以稀酸或稀碱调至pH8.5）；
（3）0.25%氢氧化钠溶液；
（4）0.01 mol/L亚硫酸钠溶液：称0.252g Na2SO3·7H2O，加蒸馏水定容至100 mL；
（5）标准氨基酸溶液：配制5 mmol/L的水溶液；
（6）ε-TNP-赖氨酸标准溶液（或丙氨酸）：配成0.5 mmol/L的水溶液。
4.测定步骤
（1）氨基酸含量的测定：
①方法1（偏碱性溶液-420 nm系统）：待测氨基酸样品液（含氨基酸0.5～4μmol）1 mL，加4% NaHCO3 1mL、0.1% TNBS 1 mL，0.01 mol/L Na2SO3 1 mL，混合后于40℃反应2h，在420 nm处测定（空白为蒸馏水代替待测液）。
标准曲线制备：取标准氨基酸溶液（5 mmol/L）0.1～0.8 mL，补充水至1 mL，同上操作步骤。
②方法2（偏酸性溶液-340 nm系统）：待测氨基酸样品液（含氨基酸0.5～4μmol）1 mL，加4% NaHCO3 1 mL、0.1% TNBS 1 mL，混合后于40℃反应2h，加1 mol/L盐酸1 mL，混合后在340 nm处测定（空白以蒸馏水代替待测液）。
标准曲线制备：取标准氨基酸溶液（5 mmol/L）0.1～0.8 mL补充水至1 mL，与上述操作同。某些氨基酸如赖氨酸、色氨酸产生沉淀，干扰测定。
（2）谷物蛋白质赖氨酸含量测定：
标准曲线制备：如没有ε-TNP-赖氨酸，可用丙氨酸或其他氨基酸。取0.5 mmol/L丙氨酸标准溶液0.1～1 mL，补充加蒸馏水至1 mL，再加4% NaHCO3 1 mL、0.1% TNBS溶液1 mL，于40℃下保温2h，加1 mL 1 mol/L盐酸，以蒸馏水稀释至10 mL，混匀，于340 nm处测定光密度值。以光密度值为纵坐标、相应丙氨酸的物质的量（μmol）为横坐标制作工作曲线。
（3）样品中蛋白质的提取：称取粉碎脱脂样品0.2 g左右（精确至1 mg），加几滴无水乙醇，混匀，再加10 mL 0.25%氢氧化钠溶液，于40℃下振荡30 min，或室温下放置过夜，再摇动混匀1 min。离心（2000～2500 r/min）5 min。
（4）TNP-蛋白质生成及水解：取离心液0.2 mL，放在有塞试管中，加4% NaHCO3 1 mL及0.1%的TNBS 1 mL，在40℃下保温2h。此后加入浓盐酸2 mL，塞上塞子，于110℃下水解2h，加水4 mL。
（5）乙醚萃取：将水解液通过滤纸全部滤到装有10 mL乙醚的分液漏斗中，以少量水（约2 mL）洗涤沉淀，振荡混匀1 min。待分层后，将水层倒入试管中（如此重复乙醚萃取2～3次），再于60℃水浴中保温以除去少量乙醚。加水补充至10 mL，在340 nm下测定溶液的光密度值。查标准曲线即可求出脱脂样品中赖氨酸含量。
5.结果计算
式中 A——测定液中赖氨酸的物质的量，μmol；
W——样品质量，g；
146.2——赖氨酸的相对分子质量；
0.2—样品测定液体积，mL；
10——样品液体积，mL；
106——克换算为微克的系数；
100——换算为百分含量。