五、比色法
1.原理
α-淀粉酶降解β-极限糊精底物溶液，在酶促反应过程中，分别在不同时间将反应混合物等分加入碘液中。随着反应时间的延长，反应混合物与碘液的显色强度降低，可据此测定酶活性。
2.仪器和用具
比色计或分光光度计，恒温水浴［调至（20±0.5）℃与（30±0.1）℃］，秒表，移液管，烧杯，pH计，试管等。
3.试剂
（1）可溶性淀粉（二级）。
（2）β-淀粉酶溶液：称取10g有酶活性的黄豆粉（粗细度为通过1.5 mm孔筛），加入85 mL水和15 mL 0.05 mol/L硫酸充分搅匀，静置15 min，抽滤。
（3）碘贮备液：将11.0 g KI溶于少量水中，加入5.50 g结晶碘，搅拌直至碘全部溶解，稀释至250 mL。在棕色瓶中暗处贮存（每月配制一次），备用。
（4）分析用稀释碘溶液：40.0 g KI溶于水中，加入4.00 mL碘贮备液并稀释至1L（用时现配）。
（5）缓冲液：溶解164 g无水乙酸钠或272 g水合乙酸钠（CH3COONa·3H2O），加入120 mL冰乙酸，加水稀释至1 L。
（6）0.2% CaCl2（二级）溶液。
（7）β-极限糊精溶液：称取5.00 g（干基）可溶性淀粉于小烧杯中，加入约20 mL水，混匀，将其边搅拌边缓慢倒入盛有100 mL沸水的500 mL高型烧杯中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移至高型烧杯中，继续搅拌并加热，缓缓煮沸2 min。加盖表面皿，在自来水中冷却至30℃以下，加入25 mL缓冲溶液及50 mL β-淀粉酶溶液，在室温下放置20 h，加入一勺浮石粉，将此溶液在10 min之内缓慢煮沸，然后继续沸腾5 min以上。冷却至30℃以下，用水定容至250 mL，摇匀，过滤。滤液中加几滴甲苯，此溶液的pH应为（4.7±0.1），在25℃以下可以连续使用5d。(https://www.daowen.com)
4.操作方法
称取谷物样品5g，倒入300 mL锥形瓶中，加入预热到30℃的氯化钙溶液100 mL，充分摇匀，置于30℃恒温水浴中，经过60 min提取，然后过滤，其滤液即为α-淀粉酶的提取液。将α-淀粉酶的提取液和β-极限糊精溶液置于30℃水浴中预热，10 min后用快速移液管吸5 mL β-极限糊精溶液至盛有15 mLα-淀粉酶的提取液的锥形瓶中，加塞后摇匀，制成混合液。吸取2 mL α-淀粉酶、β-极限糊精混合溶液，放入一个盛有10 mL稀碘溶液的50 mL容量瓶中，摇匀后置于20℃水浴中，使混合溶液温度达到20℃，然后用比色计比色。
5.结果计算
由线性关系可得到下列方程：
式中 A——α-淀粉酶活性；
m——100 mL氯化钙提取的试样质量，g；
h——试样中水分含量；
f——酶提取液的稀释倍数；
500——系数。
测定α-淀粉酶活性的方法除上述黏度法、降落值法和比色法外，还有多种方法，如自溶法等。自溶法利用淀粉酶能将淀粉转化为麦芽糖的专一性，以麦芽糖量表示淀粉酶活性。通常用100 mg试样中淀粉酶作用于淀粉水解生成麦芽糖的质量（单位：mg）表示。后两种方法无需特殊仪器，但测定较费事，在所有方法中以降落值法最为简便快速，因而得以广泛应用。进口降落值仪价格昂贵。据报道国产仪器已问世，应扩大利用。