6.2.5 希瓦氏菌培养
1.冷冻菌株复活及平板制作
在三角烧瓶中配制25 m L液体培养基（纯水∶胰蛋白胨∶大豆胨∶NaCl=100∶1.5∶0.5∶0.5，下同），用约2 mol/L 的NaOH 溶液调整p H 到7.2（0.025 mol/L MOPS为p H 缓冲剂，下同），转移5 m L 于玻璃试管中。用棉花塞密封三角烧瓶和玻璃试管，121℃环境下灭菌20 min，冷却。
将冻干管打碎，用无菌移液管从三角烧瓶中吸取1 m L 液体培养基于冻干管中，菌粉溶解后，将菌液转入盛有5 m L灭菌液体培养基的玻璃试管中，塞入棉花塞，30℃恒温静止培养24 h。
配制200 m L液体培养基于三角烧瓶中，加入2.6 g琼脂，用约2 mol/L NaOH 溶液调整p H 到7.2，棉花塞密封，121℃环境下灭菌20 min，将培养基转入10个灭菌培养皿中，冷却后制成平板。将平板倒置于恒温干燥箱中，30℃恒温，去除平板内的水分。
配制1 000 m L液体培养基于三角烧瓶中，用约2 mol/L NaOH 溶液调整p H 到7.2，棉花塞密封，121℃环境下灭菌20 min，冷却。
2.菌株的培养及生长期测量
将一次培养后的细菌转入盛有1 000 m L无菌液体培养基的三角烧瓶中，混均（转移250 m L于无菌三角烧瓶中），塞入棉花塞，置于恒温振荡器中于30℃静止培养。(https://www.daowen.com)
使用无菌移液器从250 m L三角瓶中分别转移10 m L 菌液于20支玻璃试管中，棉花塞密封，每隔1 h左右取3 m L于1 cm 测量池中，UV-vis 600 nm 波长下测量吸光度，确定对数生长期。
3.稀释平板计数
从玻璃试管中移取对数生长期（15 h）的菌液5 m L 于盛有45 m L 无菌水的三角瓶中，摇匀（稀释10倍），再用无菌移液管移取1 m L 该稀释菌液于盛有9 m L 无菌水的玻璃试管中，摇匀（稀释100倍），如此将菌液再稀释至一千到一百万倍。
用无菌移液管移取上述菌液0.1 m L于平板培养基中央（设3个平行样），用玻璃棒沿同心圆方向轻轻向外扩展，使菌液均匀分布在整个平面。室温静止5～10 min，使菌液渗入培养基，将平板倒置于恒温干燥箱中，30℃静止培养48 h。
从上述平板样品中，选择一个合适的稀释度，求出被测样品中的含菌数/m L（菌落数以30～300个/板为佳）。
4.细胞悬浊液洗涤
将对数生长期的细菌停止生长，确定剩余菌液的质量。将菌液于10 500 g条件下离心5 min，去除上清液，用p H 7.2的MOPS溶液洗脱，如此反复2次，得到菌饼。将细菌转入相同体积的p H 7.2的MOPS缓冲溶液中，得到相同细菌密度的菌液，备用。