6.3.9 钚（Ⅳ）微生物还原
考虑腐殖酸可能的双重属性，即还原和矿物质表面上的强吸附作用，本节研究可生成电子的微生物存在时腐殖酸是否能够催化还原聚合态钚（Ⅳ）及腐殖酸浓度对还原速率的影响。实验溶液的组分如表6-6所示，10 k D 滤液中的钚为水溶态，水溶态钚的价态分析方法仍采用TTA 溶剂萃取法，详细的实验过程可见研究报告[10]。
表6-6 厌氧溶液组分［pH7.2，起始239Pu浓度约为10－9mol/L（聚合物全溶）］[12]
希瓦氏菌厌氧呼吸过程中，氧化乳酸盐为醋酸盐和二氧化碳[70]，从能量上支持细胞的生长。谢金川等耦合乳酸盐的氧化和钚（Ⅳ）聚合物的还原，分析该化学反应是否具备热力学优势，见式6-40。
由表6-7所示的标准摩尔吉布斯（Gibbs）自由能，计算式（6-41）的标准摩尔吉布斯自由能变为ΔrGom=-601.4 kJ/mol。再用ΔrGom=-601.4 kJ/mol计算摩尔吉布斯自由能为ΔrGm。结合实验条件，典型值为ΔrGm= -361.1 kJ/mol（10-9mol/L Pu3+、p H 7.2、0.02 mol/L乳酸钠）。因为ΔrGm＜0，所以聚合态钚（Ⅳ）化学还原为钚（Ⅲ）aq在热力学上是可行的。
表6-7 标准摩尔Gibbs自由生成能[12]
aref.[127]Lundblad and Macdonald，2010.
bref.[68]Lemire et al.2001.
式中，R 和T 分别为气体常数和绝对温度。
在非生命体系[Pu（Ⅳ）聚合物+HA]中，lg[Pu（Ⅳ）aq]exp=-11.4＜lg[Pu（Ⅳ）aq]total=-10.4（p H=7.2、I=0），腐殖酸降低了钚（Ⅳ）聚合物的溶解度（图6-41）。当希瓦氏菌存在时，[Pu（Ⅳ）聚合物+cells+HA]体系中聚合物明显溶解，溶解百分数是[Pu（Ⅳ）聚合物+HA]体系（溶解百分数为0.1%）的90倍，表明聚合态钚（Ⅳ）经微生物，还原为水溶态钚（Ⅲ）aq。基于Pu（OH）3（am）的溶度积
= -26.2±1.5（表6-5），钚（Ⅲ）aq溶解度的热力学计算值为lg[Pu（Ⅲ）aq]total= -5.3±1.7（p H 7.2、I=0）[10]，远大于实验观察到的钚（Ⅲ）aq浓度，因此实验体系中生成的Pu（Ⅲ）aq保持水溶态，不能生成固相沉淀。
图6-41 不同厌氧体系中钚（Ⅳ）聚合物的溶解和生物还原性溶解动力学（a），溶解和生物还原性溶解百分数（b）[12]
主要实验条件：PPHA腐殖酸为25.0 mg/L、细胞密度为1.2×108cells/m L、EDTA 为5×10-4mol/L、乳酸盐为0.02 mol/L、p H 7.2
腐殖酸在钚（Ⅳ）聚合物表面形成的吸附层限制了EDTA 通过配位方式溶解聚合物。当希瓦氏菌存在时，聚合物的溶解百分数高达71%左右，[Pu（Ⅳ）聚合物+cells+EDTA+HA]体系的溶解百分数远高于非生命体系[Pu（Ⅳ）聚合物+EDTA+HA]的溶解百分数（6.0%）。同聚合态钚（Ⅳ）比较，水溶态Pu（Ⅳ）-EDTA 表现出了非常明显的被生物还原的特性（图6-41）。尽管谢金川等观察到了[Pu（Ⅳ）聚合物+cells+HA]和[Pu（Ⅳ）聚合物+cells+EDTA+HA]两个体系中钚（Ⅳ）聚合物的生物还原性溶解，但腐殖酸所起的作用仍需进一步分析。
缺少腐殖酸的[Pu（Ⅳ）聚合物+cells]体系中钚（Ⅳ）聚合物的溶解速率极其缓慢，表明希瓦氏菌分泌的胞外黄素难以将电子传递给聚合态钚（Ⅳ），希瓦氏菌不能直接还原聚合态钚（Ⅳ）。存在腐殖酸[Pu（Ⅳ）聚合物+cells+HA]的体系中聚合物的溶解百分数为9.2%，比[Pu（Ⅳ）聚合物+cells]体系的0.12%约高77倍，证实了腐殖酸能够增强聚合物的还原性溶解。腐殖酸介入了希瓦氏菌和钚（Ⅳ）聚合物间的电子传递过程，将难溶聚合态钚（Ⅳ）催化还原为钚（Ⅲ）aq。由此看来，腐殖酸扮演了双重角色，非生命环境中抑制钚（Ⅳ）聚合物的溶解，而有生命体的环境中促进聚合物发生还原而溶解。四个体系中聚合态钚（Ⅳ）的还原速率差异如图6-42所示，腐殖酸的催化还原作用显而易见。
图6-42 钚（Ⅳ）聚合物的生物还原速率[12]
速率（mol/h）=[0.2 L×Pu（Ⅲ）aq（mol/L）]/144 h
尽管式（6-44）指出聚合态钚（Ⅳ）的化学还原热力学可行，谢金川等仍疑惑聚合态钚（Ⅳ）的生物还原路径。如①为什么胞外黄素作为内生电子共轭体不能显著还原聚合态钚（Ⅳ），而腐殖酸作为外生电子共轭体却能将其还原？②为什么水溶态Pu（Ⅳ）-EDTA 很容易被希瓦氏菌直接还原，而聚合态钚（Ⅳ）却很难被还原？两种电子共轭体的醌基接受外膜c型细胞色素的电子后成为具备还原能力的氢醌种态，积累的电子是否能进一步传递给钚（Ⅳ）聚合物则受控于它们与聚合物间的氧化还原电位差。仅当电子共轭体的电位值比Eh[PuO2（am）/Pu3+]低时，共轭体才能传递电子给聚合物，还原聚合态钚（Ⅳ）为钚（Ⅲ）aq。为解决以上疑惑，谢金川等通过热力学计算取得主要电对的标准氧化还原电位，再结合实验条件计算特定条件下的氧化还原电位值，如表6-8所示。这里不详细介绍计算和方程推理过程，读者可参见有关报道的附件部分[12]。
表6-8 电极反应的氧化还原电位[12]
续 表
ap H 7.2时中点电位
（CO2/lactate）；
b由10-9mol/L Pu3+、p H 7.2计算；
c中 性p H、EDTA 过 量；
dp H7.2时的
（FMN/FMNH2）和
（RBF/RBFH2）分别基于它们的p H 7.09和7.0时的
计算而来[127]；
e乳酸盐氧化数大于0.05%。
电对CO2/lactate的电位值表达式为
（CO2/lactate）=-628.7 m V 是25℃时电对的标准电极电势。该值先由表6-7中物质的
计算得到表6-8中氧化还原半反应的
，再由
计算而来。
电对PuO2（am）/Pu3+和
/
的电势值表达式分别如下：
式（6-43）中
[PuO2（am）/Pu3+]=929.5 m V，式（6-44）中
（
/
）=154.3 m V。同理，基于表6-7物质的
逐步计算得到
[PuO2（am）/Pu3+]；中性p H 且EDTA 相 对 于Pu4+过 量 时
是主要配位种态，谢金川等使用
和
的生成常数计算
。
修正的能斯特（Nernst）方程用于计算腐殖酸的电位值Eh（HAox/HAred）[128]，即
式中，F 为法拉第常数；β 为描述电对与理想Nernst行为偏差的常数，0＜β＜1
为表观标准电位；EAC 为腐殖酸的电子接受能力（与乳酸盐氧化程度有关），mmol e-/（g HA）。
对于本文使用的PPHA 腐殖酸，Klüpfel给出了在p H 7.0 时，β=0.41±0.03、
=-122±4 m V、EACsterile=1.64 mmol e-/（g HA）[128]。因为1 mol醌基接受2 mol电子，所以n 取2。由于缺少部分活度系数，电位计算时使用离子浓度而不是活度值。图6-43为经热力学计算的电位值与乳酸盐氧化程度的关系。
图6-43 希瓦氏菌氧化乳酸盐的百分数与电对的氧化还原电位的定量关系（a），腐殖酸将从希瓦氏菌接受的电子再传递给钚（Ⅳ）聚合物（b）[12]
下面从热力学角度分析不同体系中钚（Ⅳ）的还原机制，明确体系内胞外电子的流动方向和传递路径。
（1）[Pu（Ⅳ）聚合物+cells]体系，Eh[PuO2（am）/Pu3+]＜
（FMN/FMNH2）≈
（RBF/RBFH2）。钚（Ⅳ）聚合物的氧化还原电位值低于胞外黄素的中点电位值[E oh' （F MN/FMNH2）≈
（RBF/RBFH2）≈-220 m V，p H 7.2]，因此聚合态钚（Ⅳ）的还原难以发生。由于Eh[PuO2（am）/Pu3+]受控于Pu3+活度，聚合态钚（Ⅳ）的还原反应只能在痕量Pu3+条件下发生，即Pu3+＜5.3×10-10mol/L 时才能有
（FMN/FMNH2）＜Eh[PuO2（am）/Pu3+]。当系统中Pu3+累积达到5.3×10-10mol/L 时，则ΔrGm=-F{Eh[PuO2（am）/Pu3+]-
（FMN/FMNH2）}=0，聚合态钚（Ⅳ）还原停止。由此可见，希瓦氏菌分泌的胞外黄素并不能提供足够的热力学驱动力将自身携带的电子传递给钚（Ⅳ）聚合物，从而导致[Pu（Ⅳ）聚合物+cells]体系中有极低的钚（Ⅲ）aq（3.4×10-12mol/L）。
（2）[Pu（Ⅳ）聚合物+cells+EDTA]体系，
（FMN/FMNH2）≈
（RBF/RBFH2）＜Eh（
/
）。Pu（Ⅳ）-EDTA 配 位 生 成 水 溶 态
，致 使Eh[PuO2（am）/Pu3+]≪Eh（
/
），从而
（FMN/FMNH2）≪Eh（
/
）。例如，
（实验总钚浓度2.43×10-9mol/L
）。显然，胞外黄素携带的电子很容易传递给
。热力学驱动力
印证了[Pu（Ⅳ）聚合物+cells+EDTA]体系中高产额的钚（Ⅲ）aq（1.9×10-9mol/L）。
（3）[Pu（Ⅳ）聚合物+cells+HA]体系，Eh（HAox/HAred）＜Eh[PuO2（am）/Pu3+]。如果乳酸盐被希瓦氏菌持续厌氧氧化，且产生的电子被腐殖酸的醌基完全接受，腐殖酸的氧化还原电位则不断降低，直到Eh（HAox/HAred）＜Eh[PuO2（am）/Pu3+]，如图6-43所示。例如，Eh[PuO2（am）/Pu3+]= -204.1 m V（实验值2.2×10-10mol/L Pu3+）；EAC=1.53 mmol e-/（g HA）仅需氧化0.047% 的乳酸盐，但可产生Eh（HAox/HAred）= -204.1 m V 的电位值。乳酸盐持续氧化，Eh（HAox/HAred）则变得更负，氧化数为0.05%时，Eh（HAox/HAred）= -241.9 m V＜Eh[PuO2（am）/Pu3+]，聚合态钚（Ⅳ）的还原变得热力学有利。本体系2.1×10-10mol/L的钚（Ⅲ）aq比[Pu（Ⅳ）聚合物+cells]体系的钚（Ⅲ）aq高62倍，证实腐殖酸作为外生电子穿梭体的催化还原作用。
（4）[Pu（Ⅳ）聚合物+cells+EDTA+HA]体系
。水溶态Pu L4-
2有相对高的氧化还原电位，能从胞外黄素和腐殖酸接受电子，如图6-43所示。实验总钚3.14×10-9mol/L（
）和2.22×10-9mol/L Pu（Ⅲ）aq（
）条件下，计算得
。很明显-220 m V 电位值的胞外黄素能将
还原为
。即使希瓦氏菌仅氧化痕量的乳酸盐，如1.56×10-5%，也可导致Eh（HAox/HAred）＜131.7 m V。由此，这两种电子穿梭体均可对
的还原作出贡献，是本体系具有最高的Pu（Ⅲ）aq产额（2.2×10-9mol/L）的原因。
由上，希瓦氏菌厌氧呼吸过程中释放的电子能传递给水溶态Pu（Ⅳ）-EDTA，使其还原为Pu（Ⅲ）aq，但难以还原聚合态钚（Ⅳ）；腐殖酸作为外生电子穿梭体，从希瓦氏菌接受电子（氧化还原电位降低），再将电子传递给聚合态钚（Ⅳ），从而将其还原为Pu（Ⅲ）aq，钚的溶解度增大，移动能力增强。图6-44直观展示了聚合态钚（Ⅳ）和水溶态Pu（Ⅳ）EDTA 的微生物还原驱动力和体系内电子传递的路径。
前期研究结果表明，由于腐殖酸在钚（Ⅳ）聚合物表面形成吸附层，聚合物溶解度随腐殖酸浓度增大而降低[10]。腐殖酸吸附层有可能限制被包裹的钚（Ⅳ）聚合物接受胞外电子的能力。由此等产生新的疑问：腐殖酸的浓度达到一定值时，还有催化还原聚合物的能力吗？腐殖酸很可能存在一个临界浓度值，小于此值时其催化还原能力与浓度呈正相关，大于此值时则呈负相关。为此谢金川等开展了钚（Ⅳ）聚合物的还原速率与腐殖酸浓度（0～150.5 mg/L）的关联性研究。
图6-44 聚合态钚（Ⅳ）和水溶态Pu（Ⅳ）-EDTA 的热力学还原机制[12]
从图6-45可以看出，聚合态钚（Ⅳ）的还原速率随腐殖酸浓度的增大而增大，直到腐殖酸达到15.0 mg/L[4.1×10-15mol Pu（Ⅲ）aq/h（HA=0）到4.2×10-13mol Pu（Ⅲ）aq/h（HA=15.0 mg/L）]。显然，腐殖酸浓度较低（0～15.0 mg/L）时其浓度增大，醌基含量增高，传递给钚（Ⅳ）聚合物的电子越多，聚合态钚（Ⅳ）的还原速率则越快。钚（Ⅳ）聚合物的溶解百分数从0.12%增大到12.3%（图6-46）。
图6-45 不同浓度的腐殖酸体系内，钚（Ⅳ）聚合物还原性溶解时的钚（Ⅲ）aq（a），聚合态钚（Ⅳ）的还原速率与腐殖酸浓度的关系（b）[11]
实验条件：p H 7.2（0.005 mol/L MOPS 为p H 缓冲剂）、钚（Ⅳ）聚合物的起始浓度为5.2×10-9mol/L239Pu、腐败希瓦氏菌密度为108cells/m L、乳酸盐为0.02 mol/L
图6-46 不同浓度的腐殖酸体系内，钚（Ⅳ）聚合物的还原性溶解的百分数[即聚合态钚（Ⅳ）的还原百分数]（a） 144 h 时还原性溶解百分数与腐殖酸浓度的关系（b）[11]
然而，腐殖酸浓度大于15.0 mg/L时聚合态钚（Ⅳ）的还原速率反而变慢。实验结果证实了谢金川等的猜想，聚合态钚（Ⅳ）的还原速率不随腐殖酸浓度的增大而无限增大，腐殖酸的催化还原作用存在临界浓度值（15.0 mg/L）现象。腐殖酸浓度较高（50.1～150.5 mg/L）时，聚合态钚（Ⅳ）的还原速率仍比无腐殖酸体系的还原速率大。如，1.6×10-13mol Pu（Ⅲ）aq/h（HA=150.5 mg/L）是4.1×10-15mol Pu（Ⅲ）aq/h（HA=0）的39倍。因此，腐殖酸吸附层并不能完全包裹钚（Ⅳ）聚合物，仍有吸附层缺陷，聚合物可有限地接受胞外电子。
总之，聚合态钚（Ⅳ）的还原速率与腐殖酸浓度呈非单调关系，腐殖酸的催化还原临界浓度约为15 mg/L。高浓度腐殖酸（＞15 mg/L）形成的吸附层限制了聚合物与胞外电子的接触，降低了聚合态（Ⅳ）被还原的概率。