基因克隆概念及步骤

基因是具有遗传学效应的DNA 或者RNA 片段，甚至是蛋白。基因组学的发展为人类提供了大量的基因组信息，而功能基因组学主要研究目标也是进行基因组功能注释。在研究基因功能之前，需要分离、克隆目的基因。分离与克隆目的基因是进行基因结构、基因功能和表达调控研究的基础，因而，基因克隆是生命科学研究的一个重点。由于基因组计划耗费的人力、物力和财力都是巨大的，所以并非每一种生物都要拿来测序，因此，利用基因克隆技术将会使人们更经济实惠地获得有利的基因。

1969 年，美国哈佛大学的R.Backwith 博士所领导的研究小组应用DNA 杂交技术成功地分离了大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，开创了基因分离的成功先例，从而激发了人们从不同角度分离基因的积极性。1972 到1973 年，以H.Boyer 和P.Berg 等人为代表的科学家在基因分离技术的基础上发展了有关重组DNA 的技术。P.Berg 及其同事于1972 年用EcoR I切割SV40的DNA和λphage的DNA，并将它们连接获得第一个重组DNA分子。该工作只是在化学水平实现基因重组，并未进行生物学意义上的可遗传性和可增殖性验证，但他们的工作拉开了DNA重组工作的序幕。后来，H.Boyer等科学家在1973年完成重组质粒转化大肠杆菌的试验，完成第一个基因克隆，由此宣告基因克隆技术的诞生。

克隆（clone），作名词使用时表示从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体；作动词使用时，指产生这一群体的过程。基因克隆，也称分子克隆（molecular cloning），是指在体外，通过分子生物学的方法将各种来源的目的基因与运载载体重组在一起，然后导入受体细胞，筛选出含目的重组体的转化子细胞，使目的基因在受体细胞中得到扩增（或表达）并提取获得，从而达到对目的基因的生物学特性进行研究的技术方法。概括地讲，基因克隆包括以下几个步骤：

（1）选取用于基因克隆的DNA 材料及采用各种方法分离获得带有目的基因的DNA 片段：从复杂的生物体基因组中，经酶切和PCR 扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段，获得所需的基因；或者从特殊材料中提取所需基因的mRNA后，经反转录获得所需要的基因；或者根据基因所含的遗传密码及排列顺序，用化学方法人工合成所需基因。

（2）在体外，将带有目的基因的外源DNA 片段连接到载体分子上，构建成重组DNA分子。基因载体具有自我复制能力，经处理后，能与外来基因相结合。目前基因载体主要有两大类，一类是病毒（包括噬菌体），一类是质粒。(https://www.daowen.com)

（3）将重组DNA 分子转移到适合的宿主细胞：重组DNA 分子是带有目的基因运载体。用转化或者转导法将重组DNA 分子转到适当的受体细胞内，使它们通过自体复制和增殖，从而扩增产生大量特定目的基因。

（4）从细胞繁殖群体中筛选出带有重组DNA分子的受体细胞克隆。

（5）培养克隆筛选出的受体细胞，从受体细胞内提取扩增的重组质粒，并对扩增的目的基因进行鉴定。

（6）将目的基因克隆到合适的表达载体上，再次导入宿主细胞，经过反复筛选、鉴定和测定分析，最终获得高效、稳定的基因工程细胞。

（7）大量培养繁殖筛选得到的基因工程细胞，或直接分离纯化获得的外源基因表达产物，或者利用基因工程细胞对其他物种进行改造。