陇绿棉3号胚性愈伤组织的诱导及植株再生[4]
国内外不少学者对棉花组织培养植株再生进行了探讨，并建立了不同的培养程序或方法，获得了抗虫、抗除草剂等转基因棉株，但这些研究均是采用一些模式品种，待获得转基因植株后经过杂交转育的方法将抗虫、抗除草剂等性状转育到当前主栽品种中去，使转基因棉花的培育时间长，不利于新成果的快速应用。高效的植株再生体系是遗传转化成功与否的重要前提条件。研究证明，以棉花胚性愈伤组织为受体进行遗传转化是最高效、简易的转基因途径，其前提就是体细胞胚胎的发生。通过营养和微环境调节进行代谢胁迫，可以缩短培养时间、提高成胚频率和降低畸形胚频率，以胚性愈伤作为受体的遗传转化可以有效缩短转化周期。
本研究通过对绿色棉-陇绿3 号的再生条件进行试验研究，在前人对陆地棉和海岛棉研究相对成熟的再生体系基础上，首次开展了特早熟彩色棉品种的胚胎发生机理研究，并建立了稳定高效的彩棉再生方法，拓展了可再生彩色棉花的基因型，为进一步的转基因研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 供试材料
供试材料为特早熟绿色棉品种-陇绿棉3号，是甘肃省农业科学院作物所自育品种。
1.2 无菌苗的培养
精选经硫酸脱绒后的试验种子，先用70%乙醇涮洗30 s杀菌，再用30%过氧化氢浸泡3 h 灭菌，后用无菌水冲洗5～8 遍，并在无菌水中浸泡过夜。种子露白后，于超净工作台中剥去种皮，接种于1/2 MSB 发芽培养基中培养。培养温度为（28±1）℃，光照强度2000 lx，以光照和黑暗培养相交替为设计依据，设置4 个发苗处理：暗4 d；暗3 d/光3 d；暗4 d/光2 d；暗5 d/光2 d。每处理重复3 瓶（100 mL 三角瓶），每瓶5 粒种子。处理完毕后切取下胚轴，转入添加0.1 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 2,4-D的MSB培养基诱导愈伤组织。
1.3 愈伤组织的诱导与增殖
将获得的无菌苗下胚轴在超净工作台上切成5～8 mm 小段，平放于愈伤诱导培养基上。此设计以MSB 培养基为基础，采用不同激素、不同浓度组合，共设置9 个处理（表1）。每处理重复10 瓶，每瓶放置6 段无菌苗，30 d 后统计出愈数量，观察愈伤组织状态，计算不同处理下愈伤组织诱导率（诱导率=诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100%）。将诱导出的愈伤组织统一继代到添加0.1 mg·L-1KT+0.05 mg·L-12,4-D 的MSB 培养基上，25 d继代一次，继代一到两次。
表1 愈伤诱导培养基不同处理
Table 1 The different media of callus induction（mg·L-1）
1.4 胚性愈伤组织的诱导与增殖
当愈伤组织在增殖培养基上生长直径达1～2 cm 时，采取直接转入和剔除下胚轴两种方式转接至去除激素并添加1.9 g·L-1 KNO3和2.0 g·L-1 gelrite 的胚性愈伤诱导培养基上。待分化出初性胚性愈伤后，将其转入三种不同浓度NH4NO3处理的MSB 培养基上，分别为MSB/MSB（NH4NO3减半）/MSB（去除NH4NO3），并添加1.9 g·L-1 KNO3、1.8 g·L-1凝固剂gelrite、0.1 g·L-1天冬酰胺和0.1 g·L-1谷氨酰胺。20 d继代一次，继代一到两次。
1.5 体细胞胚胎的发生与植株再生
将增殖后的胚性愈伤转入去除NH4NO3的MSB 培养基上，并设置三种不同浓度的IBA处理，分别为0.1 mg·L-1KT+0.01/0.1/0.4 mg·L-1 IBA。15 d 继代一次，继代两次后统计体胚诱导率。挑选出成熟的子叶胚置于1/2 MSB培养基中培养，25 d继代一次，直至发育成苗。
2 结果与分析
2.1 光暗培养周期与无菌苗生长的关系
四种光暗周期交替处理研究结果表明：暗4 d培养的彩棉无菌苗生长矮小，茎段过细；经培养后，愈伤组织不易膨大，诱导率低。培养7 d（暗5 d/光2 d）的无菌苗切割时韧性大，愈伤组织诱导和生长缓慢。总培养时间为6 d 的处理棉苗均生长状态良好，但暗4 d/光2 d 处理的棉苗下胚轴明显比暗3 d/光3 d 处理粗壮、均匀，愈伤组织诱导的初始时间同比提前1～2 d。这可能与下胚轴幼嫩度有关，即外植体愈幼嫩，其细胞和组织分生能力愈强，脱分化能力愈强；而老化部位脱分化能力较弱。这与于娅等研究的近子叶端的下胚轴切段较近根端出愈速度快的原理一致。因此，暗4 d、光2 d 处理是陇绿棉3 号无菌苗培养的最佳光培养条件。
2.2 外源激素对愈伤组织的诱导与增殖的影响
试验结果表明（表2），附加有0.1 mg·L-1 2,4-D+（0.05～0.3）mg·L-1 KT 和0.1 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1IAA 的MSB 培养基上，诱导形成的愈伤组织质地疏松，生长旺盛，有利于胚性愈伤组织的分化。以0.1 mg·L-1浓度为界限，KT 高于或低于这个浓度，对愈伤组织的生长状况影响不大，对出愈的起始时间有明显影响；高于0.1 mg·L-1浓度的KT 组合下出愈时间同比其他处理提前2～3 d。2,4-D 浓度高于0.1 mg·L-1，愈伤组织生长稀松，易出现水渍化及褐化倾向；低于此浓度，下胚轴两端出愈慢，愈伤组织生长致密且呈白色，不易膨大。研究结果显示，受体材料对2,4-D 的浓度更敏感，适宜浓度的生长素与一定浓度范围内的分裂素组合有利于彩棉愈伤组织的诱导。
诱导出愈伤组织以后，将其转至2,4-D 减半的培养基继代培养。2,4-D 虽然是脱分化最有效的植物生长调节剂，但对体细胞胚胎的发生有阻碍作用。因此在愈伤组织形成以后，应及时减弱或去除2,4-D 胚性细胞才能正常发育，否则前期2,4-D 累积使用会在后期抑制体细胞胚的发育和成熟。(https://www.daowen.com)
2.3 愈伤组织继代方式的优化
棉花下胚轴在愈伤组织诱导培养基上继代1～2次后，愈伤块直径会达到1～2 cm；将此愈伤再继代到胚性愈伤诱导培养基上时，需要剔除下胚轴后再进行继代。关于继代方法，张寒霜等认为：为了保持愈伤组织的活力，可将下胚轴与愈伤组织一起转接到继代培养基上，这与本研究结果恰好相反。本研究结果表明，剔除下胚轴的彩棉愈伤组织生长较快，状态疏松，呈黄绿色。未剔除下胚轴进行继代，下胚轴因脱分化变得干瘪，转入新鲜培养基后容易从愈伤底部起发生褐变，从而导致愈伤褐化死亡，不利于愈伤组织的分化。
2.4 胚性愈伤的挑选与增殖的影响因素
研究表明，在愈伤组织的诱导生长过程中，愈伤状态通常可分三类：第一类是呈黄绿色或灰白色，质地疏松，生长旺盛，培养基消耗慢；第二类是深绿色、白色或是绿色上带白色突起，质地坚硬，生长缓慢；第三类则是色泽鲜亮，质地特别疏松，生长旺盛，繁殖迅速，培养基消耗快，呈疯长型。第二和第三类型较难诱导出胚性愈伤，应尽早淘汰。第一类的愈伤组织中，还有一种愈伤底部逐渐出现褐化。试验证明，这类愈伤组织虽然有褐化现象，但只要其质地疏松，仍旧有分化胚性愈伤的可能性，可进行保留继代。
本研究将诱导出的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，一般经过2～4 次继代，可观察到在愈伤组织的侧边缘或是底部有淡黄色松散的初性胚性愈伤的形成。将其挑出转接到胚性愈伤增殖培养基上，使其扩繁。研究结果表明，放置在MSB培养基上的胚性愈伤增殖较慢，而放置在去除NH4NO3的MSB 培养基上的初性胚性愈伤会逐渐褐化死亡。经过继代40 d 后观察得出：NH4NO3减半、KNO3加倍的MSB 培养基最适宜该品种的胚性愈伤组织扩繁，其增殖倍数是MSB处理的1.5倍。
2.5 体细胞胚胎的发生条件和分化成苗方法的优化
棉花体细胞胚胎分化阶段主要包括：球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚等四个阶段，其中球形胚、心形胚、鱼雷前期胚均不能萌发成苗，只有子叶胚和鱼雷后期胚可以萌发成苗。因此选择适宜的培养基和培养条件，获得更多的子叶胚是胚性愈伤分化培养的重要目标。研究结果表明：0.1 mg·L-1KT+0.01 mg·L-1IBA 处理对胚性愈伤的影响不大，此处理下有少量球形胚发生；0.1 mg·L-1KT+0.1 mg·L-1IBA 处理可诱导胚性愈伤向球形胚发育，诱导率达90%以上；添加0.1 mg·L-1KT+0.4 mg·L-1IBA 处理可诱导子叶胚直接发生，诱导率达75%。
表2外源激素对陇绿3号愈伤组织诱导的影响
Table 2 The effect of exogenous hormone combinations on green cotton’s callus induction in Longlv 3
将子叶胚挑选出来，置于撤除激素的1/2 MSB培养基上继代2～4次可分化成苗。针对体胚成熟诱导阶段，缩短获得成熟体细胞胚胎的周期，有利于提高彩棉再生体系的效率。
3 结论
以陇绿棉3号为试验材料，针对从外植体培养到胚状体发生及分化成苗整个组织培养过程的不同阶段，研究探索绿色棉-陇绿棉3 号的再生条件，获得再生植株，为拓宽彩色棉再生基因型和转基因研究奠定了基础。研究结果表明，陇绿棉外植体的最适培养条件为：暗4 d，光2 d处理；愈伤组织诱导最佳激素组合为0.1 mg·L-1 2,4-D+（0.05～0.3）mg·L-1KT或0.1 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT+0.1 mg·L-1 IAA 的MSB（MS 培养基无机盐+B5 培养基有机成分）培养基；愈伤分化的最适条件为MSB 中添加1.9 g·L-1 KNO3和2.0 g·L-1凝固剂gelrite；胚性愈伤增殖培养基为MSB（NH4NO3减半）中添加1.9 g·L-1 KNO3并添加1.8 g·L-1凝固剂gelrite、0.1 g·L-1天冬酰胺和0.1 g·L-1谷氨酰胺。在去除NH4NO3，添加0.1 mg·L-1 KT和0.4 mg·L-1 IBA 的MSB培养基上胚胎发生率和子叶胚萌发率均达到峰值，且子叶胚在1/2 MSB培养基上可成功分化成苗。
本研究主要针对彩色棉组织培养中各阶段的一些影响因素进行了初步探讨，希望能为开展彩色棉的进一步研究工作奠定基础。
参考文献（略）
刘新星，罗俊杰，陈玉梁，陈子萱，李忠旺，厚毅清，石有太，裴怀弟：
甘肃省农业科学院生物技术研究所
曲延英：新疆农业大学农学院
【注释】
[1]本论文在《核农学报》2016年第30卷第6期已发表。
[2]本论文在《中国沙漠》2015年第35卷第6期已发表。
[3]本论文在《江苏农业科学》2015年第43卷第9期已发表。
[4]本论文在《棉花学报》2012年第24卷第6期已发表。