四、转化影响因素
1.影响酶解法分离原生质体的因素
原生质体培养需要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体。原生质体分离主要受外植体材料、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间和温度等的影响。
（1）外植体材料
生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物（suspension cultures）、原球茎、花瓣和叶表皮等。叶肉细胞是常用的材料，因为叶片很易获得而且能充分供应。取材叶片所在植株的年龄和生长条件对分离的原生质体产量和活力有很大影响，一般用立体培养植株的无菌叶片或低光照强度（1000 μW/cm2）、短日照、温度20～25 ℃、相对湿度60%～80%生长的植株。愈伤组织或悬浮细胞也是分离原生质体的常用材料，愈伤组织或悬浮细胞可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无须消毒。以活跃生长的幼龄愈伤组织或频繁继代的处于指数生长早期的细胞为宜。
（2）酶液组成和浓度
用来分离植物原生质体的酶制剂主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和离析酶等，纤维素酶和果胶酶是分离植物细胞原生质体所必需的两种酶。前者消化细胞壁纤维素，后者降解中胶层。大多数植物分离原生质体时，纤维素酶浓度为1%～3%，果胶酶为0.1%～1%，但也有很多例外。酶的活性与pH 有关，反应温度、酶浓度和反应时间都对酶解效率有影响，需要经过多次试验才能确定。
（3）渗透压
原生质体操作需要在一定渗透压存在下进行，在合适渗透压的溶液中，新分离出来的原生质体是球形的，原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更稳定，较高水平的渗透剂可以阻止原生质体破裂和出芽，但也会抑制原生质体的分裂。山梨醇和甘露醇是常用的渗透剂，葡萄糖、果糖、半乳糖同样也是渗透调节剂。
（4）酶解条件(https://www.daowen.com)
酶解条件最主要的是酶处理时的温度和pH。不同的酶需要的pH 值不一样，但pH 大于6时不利于原生质体生存。一般而言，分离原生质体的培养时间与温度成反比，可是高温下短时间分离的原生质体不适于培养，易发褐和破裂。但酶处理时间一般不超过24 h。一般常用温度是23～32 ℃。酶处理时一般在暗处培养。叶片分离原生质体可在静置条件下进行，悬浮细胞由于壁厚，培养（分离）过程中间断低速震荡有利于酶渗透。
2.质粒的质量和浓度
质粒的质量影响转化效率。刘鑫等（2017）在PEG 介导的小麦原生质体转化中发现，当质粒用量加大时，转化效率受核酸酶影响程度降低，转化效率得到了提升。但是质粒超过20 μg 后，转化效率不再大幅提升。付莉莉（2009）在棉花原生质体电击转化过程中也得到类似的结论，质粒浓度为100 ng/μL时，转化效率最高，达5.36%；浓度为50 ng/μL，转化效率也低（4.55%），可能是质粒太少而使原生质体吸收不够。然而，当其浓度达到150 ng/μL 时，转化效率反而降为4.17%。赵宏波和陈发棣（2004）认为，PEG 法转化原生质体的转化率不仅受外源基因浓度的影响，而且受其构象、DNA 序列的重复性影响，线状DNA 的转化能力可能高于环状质粒DNA，外源DNA 的重复性越高转化频率越高。陈振东（1994）在用PEG 法把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体时认为，1 mg/mL 的小牛胸腺DNA（cTDNA）起携带DNA的作用，其作用不能被相同浓度的质粒DNA所完全代替。
3.与转化方法相关的因素
（1）PEG溶液浓度和pH值
PEG 溶液既要保持原生质体活力，又要确保外源DNA 进入原生质体，所以其浓度和pH 值对转化效率影响很大。周冀明等（1995）在诸葛菜子叶原生质体GUS 基因瞬时表达中发现，20% PEG 溶液处理后原生质体破碎严重，培养2 d 后基本观察不到完整细胞，15%、13.3%和10%PEG 溶液处理后对原生质体损伤不严重，细胞基本完整，以较高浓度15%PEG 溶液处理的原生质体GUS 表达最强；同时作者也发现，高pH 值的PEG 溶液有利于将质粒DNA 导入原生质体，pH8.0 的PEG 导入效率远比pH5.8 的PEG 高。程振东（1994）在甘蓝型油菜原生质体转化中也得到相同结论，PEG 终浓度同为20%时，用pH 值为8.0的PEG溶液的基因表达强度显著高于pH值为5.7的。
（2）电击参数对转化效率的影响
电击转化是在外加电场条件下，通过高压直流电脉冲将原生质体的细胞膜击穿，使外源DNA 进入原生质体。要同时保持较高的原生质体活力和外源基因的成功导入，需要选择适宜的电击参数。直流电场强度、脉冲时间是影响转化效率的两个重要因素。朱文静等（2015）在电击法介导的人参大片段DNA 转化灵芝原生质体的研究中进行了适宜电压大小的筛选，于晓玲等（2013）在橡胶树原生质体中瞬时表达红色荧光蛋白的研究中、宋唯一（2005）在外源DNA电击转化小麦半原生质体的研究中也进行了电击参数的筛选和优化。