二、转化方法
主要包括植物原生质体的分离和外源基因转化两个重要部分。
1.PEG介导的原生质体转化法
由于PEG法不需要特定的仪器，结果也比较稳定，所以是植物原生质体遗传转化中最常用的方法之一。该方法由Krens等首创，于1982年首先进行了烟草原生质体转化。
（1）植物原生质体的分离
原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力，包括植物材料的前处理、酶处理和原生质体的纯化、活力测定和密度调整。植物材料的前处理包括对非无菌状态的植物组织的消毒处理和为了促使酶解更充分而采取的诸如撕去下表皮、组织切块、抽真空等措施，以及原生质体愈伤组织预诱导。
酶处理中所采用酶的种类、酶解液pH、酶解温度，以及酶解组织与酶的量都对原生质体的产量产生影响。原生质体的纯化是指将酶解液中的完整的未受损的原生质体与亚细胞碎屑、未被消化的细胞和碎裂的原生质体分离开来。纯化方法有：沉降法、漂浮法、界面法等。
原生质体活力测定常用的有以下三种方法：
①二乙酸荧光素（FDA）法
FDA 本来没有荧光，当其进入细胞后被脂酶分解为具有荧光的极性物，不能透过质膜，而是留在细胞内发出荧光。因此能发出荧光的是具有活性的原生质体。
②酚藏花红染料法
具有活力的原生质体吸收染料显红色，无活力的不能吸收染料而显示白色。
③伊文思蓝染色法
有活力的细胞不能吸收染料为无色，而没活力的细胞则能吸收染料显蓝色。
（2）外源基因转化
外源基因转化包括质粒DNA 的提取纯化和转化。首先将原生质体用转化溶液重悬，然后先后轻柔加入质粒DNA溶液、PEG诱导液，孵育培养。
2.植物原生质体电击转化法(https://www.daowen.com)
电击转化法介导外源基因转化植物原生质体操作简便，没有化学物质对原生质体的伤害，特别适合那些对农杆菌介导不敏感的植物，是外源基因转入的一种理想方法，但是需要专门的电击仪才能操作。电击转化法基于短时、高压电脉冲作用在原生质体膜上出现的短暂可逆性小孔和新产生的渗透点作为瞬间通道，为外源DNA 分子进入原生质体提供通道，从而完成外源DNA 的转入。Foromn 等1986 年首次在烟草、胡萝卜和玉米原生质体中成功进行了外源基因的电击转化。
转化步骤：
（1）将电击缓冲液加入分离的原生质体中，重悬，离心3 min，弃上清液，再加入适量电击缓冲液，将原生质体密度调整到1×106～2×106个/mL。
（2）加入一定浓度的质粒DNA和鲑鱼精子DNA，混合后分装于电击反应槽内。
（3）冰浴5 min。
（4）选择不同参数电击。
（5）冰浴10 min。
（6）600 r/min离心3 min除去电击缓冲液，用液体培养基洗涤。
（7）将原生质体包埋于固体培养基中，28 ℃黑暗条件下选择培养。
3.农杆菌介导的植物原生质体转化法
转化步骤：
（1）分离植物原生质体。
（2）携带有外源基因的农杆菌菌液制备。
（3）将植物原生质体与Ti 或Ri 质粒上携带有外源基因的农杆菌在液体培养基上共培养2～3 d。
（4）原生质体的选择培养、抗性植株再生。
（5）抗性植株的分子鉴定。