黄芪与红芪SSR引物的筛选及鉴定指纹代码的构建[2]
黄芪（Astragalus membranaceus）和红芪（Hedysarum polybotrys）是常用中草药之一，两者同科不同属，黄芪为黄芪属，红芪为岩黄芪属。《中国药典》上表明，黄芪与红芪都具有益气固表、利尿消肿、脱毒和敛疮生肌的功效，两者经常混用，然而，随着两者比较研究的增多，有学者发现两者的化学成分、药理、药效均存在明显的差异，临床应用需要区分，因此，黄芪和红芪的鉴别研究显得十分必要。
目前，用于中草药鉴别的方法有多种，其中，液相色谱鉴定法（HPLC）和分子标记鉴定法相关的研究较多。液相色谱鉴定法不仅可鉴别中药材内含物的种类和含量，还可以对药材的质量进行评估，而分子标记鉴定法通过分析基因位点的差异，对没有详细背景信息的中药材鉴别更加有效，但从简单实用，成本低廉的方向考虑，分子标记鉴定法有更好的应用前景。
本文省去SSR 引物的开发过程，利用近缘种质SSR 引物的通用性。收集的豆科SSR 引物，逐一筛选和验证，获得可用于鉴定的核心引物，标记电泳图谱中的特异性位点，为黄芪与红芪的分子鉴定提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
参试黄芪与红芪的种子由甘肃省定西市旱作农业科研推广中心提供，黄芪为陇芪1号，红芪为甘肃道地种质，2014年11月份种植于甘肃省农业科学院温室，待隔年出苗后，随机选取黄芪与红芪样本各200份，采集其新出嫩叶进行基因组提取。
1.2 方法
1.2.1 总基因组的提取与检测
采用“TIANGEN 植物基因组DNA 提取试剂盒”提取基因组，通过紫外分光光度计检测纯度及浓度，定量基因组为10 ng/μL，将基因组保存于-25 ℃冰箱中备用。
1.2.2 引物筛选
初筛：以黄芪和红芪各一个样本互相对照，对试验中合成的101 对SSR 引物进行筛选，通过电泳结果选出有差异的引物。
复筛：随机选取32 份黄芪样本和30 份红芪样本，对初筛获得的引物进行复筛，通过电泳结果选出条带清晰、便于统计的低多态性的引物作为筛选引物，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司统一合成。
1.2.3 扩增及产物的检测
采用Bio-Rad T100 梯度PCR 仪对黄芪基因组进行扩增。扩增程序：95 ℃变性5 min，95 ℃变性1 min，47～60 ℃（温度随引物不同而定）退火40s，72 ℃延伸45s，共30 个循环，72℃后延伸5 min，4 ℃冰箱保存；反应体系：25 μL体系中2×Taq Master Mix 12.5 μL，100 μmol/L 的上下游引物各1 μL，基因组1 μL，去离子水9.5 μL，Tap DNA Master Mix 为Takara品牌，购自宝生物工程（大连）公司。
扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，210 V 电泳1.5 h 左右。电泳结果用Bio-Gel D6C XR+凝胶成像系统和尼康相机分别观察、拍照及保存。
1.2.4 数据统计与分析
整理电泳照片，人工选取分子量范围为100～500 bp 的清晰可辨的扩增条带进行统计分析，对于同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带为1个位点，有条带的记为“1”，无带的记为“0”，依次构建数据矩阵。计算引物多态性信息含量（PIC），PICi=2fi （1-fi），式中，PICi表示引物的多态性信息含量，fi表示有带所占的频率，1-fi表示无带所占的频率。带型频率由PopGen32 软件计算。利用NTSYSpc2.10e 软件计算参试样品的遗传距离（GD）和遗传相似系数（Gs），然后用非加权配对算术平均法（UPGMA）构建亲缘关系聚类树状图。
1.2.5 鉴定指纹图谱的构建
参照张婉指纹图谱代码构建方法，进行改进，将引物按照顺序进行编号，依次为A、B、C……，再依据扩增条带分子量从大到小的顺序记录黄芪和红芪共有特异性位点处条带的分子量，再记录不同的SSR引物扩增出现的特异条带，如果一份材料经同一引物扩增同时出现多特异鉴别条带，则用“-”连接数字，经过不同的引物扩增后将由字母和阿拉伯数字组成的一系列带型编号，便形成了SSR鉴别代码。
2 结果与分析
2.1 SSR引物筛选结果
101对引物经过初筛后，共获得31份差异引物，差异引物对62份参试样本的扩增电泳结果有两种表现特征，其中引物ZYS7 扩增结果泳带较多，PCR 产物分子量为100～500 bp，泳带达到20余条，呈现丰富的多态性，而引物ZYS3的PCR 扩增电泳结果，泳带主要集中在100～400 bp，不同泳道，有7～9 条泳带，泳带清晰，方便统计。针对本次试验目的，舍弃类似引物ZYS7 的电泳带型，以引物ZYS3 的PCR 扩增电泳结果为标准（图1），共计筛选出6对鉴定的核心引物（表1）。
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图1 不同引物PCR产物凝胶电泳结果
Fig.1 Gel electrophoresis results different primers PCR products
表1 SSR核心引物序列
Table 1 Primers for SSR
2.2 核心SSR引物的多态性分析
通过分析62份参试样本的电泳图谱，6对核心引物共扩增出55个多态位点，平均多态性位点百分比为100% （表1），引物多态信息含量（PIC）为0.290～0.426，SSR 引物多态信息含量是衡量微卫星位点多态性高低的较好指标，当PIC＞0.5 时，具有高度多态性，当0.25＜PIC＜0.5时，具有中度多态性，当PIC＜0.25时，具有低度多态性，因此，本次试验筛选的核心引物多态性适中。
2.3 聚类分析结果
聚类分析结果显示（图2），在相似系数为0.4处，62份黄芪和红芪混合样本被区分归类，准确率达到100%，其中黄芪样本相似区间为0.68～0.93，红芪样本相似区间为0.7～0.9，各群体内样本分类繁多。该结果表明，筛选获得的6对核心引物可以作为黄芪与红芪SSR电泳鉴别引物，其PCR电泳结果包含黄芪与红芪鉴别的特异性位点。
图2 62份黄芪、红芪样本基于核心SSR引物遗传相似性的UPGMA聚类图
Fig.2 Sixty-two Astragali Radix and Hedysari Radix based on SSR genetic similarity of UPGMA clustering
“H”代表黄芪，“R”代表红芪。
2.4 黄芪与红芪的鉴定指纹图谱
通过统计62 份黄芪、红芪样本的电泳图谱，发现了13 处特异性位点，其中MS262、MS324和MX60引物各有3处特异性位点，引物MX153有2处特异性位点，引物D2和ZYS3各有1 处特异性位点。以引物A—F 的顺序（图3），鉴定图谱代码为：A350B340-250-200C400-270-240D200-180-150E280-180F100。
图3 黄芪与红芪鉴别的特异位点
Fig.3 The electrophoresis identify specific site of Astragalus and Radix Hedysari
注：图中M 为marker；A—F 分别代表引物D2、MS262、MS324、MX60、MX153 和ZYS3，每个引物扩增显示的4个泳道，1、2泳道为黄芪扩增产物，3、4泳道为红芪扩增产物；“←”表明该引物的特征位点处。
Note: M as a marker in figure；A - F represent primers D2，MS262，MS324，MX60，MX153 and ZYS3，each primer amplification show four lane，lane 1,2 for astragalus membranaceus amplification products，3,4 lane for Radix Hedysari amplification products；“←”show that the characteristics of primer sites.
3 讨论
3.1 黄芪、红芪分子鉴定SSR引物筛选标准
引物多态信息含量是SSR 引物筛选的参考标准，一般来说，引物多态信息含量越大，可以对物种进行更丰富、细致的遗传分析，尤其对同种属不同品种的鉴别，更加精准，如张金渝在EST-SSR标记三七选育品系的研究中，所用引物平均多态信息含量为0.78，不仅分析了17 份三七材料的基因多样性和遗传分化率，还对参试材料进行了分类，为三七育种提供了依据。宋海斌利用筛选获得的18 对SSR 引物，平均多态性信息含量为0.68，对105 份甜瓜品种（系）进行了指纹图谱库的构建研究，为主要甜瓜品种的鉴定提供参照。但本次试验鉴别的黄芪与红芪，为不同种属物种，鉴定结果力求准确，不求精确，因此，鉴定体系选择了低态信息含量的引物，聚类分析结果显示，低态信息含量的引物构成的鉴定体系可以准确区分参试的黄芪与红芪样本。该结果表明，中低态信息含量的引物，用于物种种属的鉴别是可行的。
3.2 SSR分子标记的优点
黄芪与红芪的分子鉴定已有相关研究。龙平在《黄芪与红芪鉴别的特异性PCR位点的研究》中，开发了特异性检测的双向引物，通过PCR琼脂凝胶电泳进行鉴别，该方法特异性高，应该是目前最实用的分子鉴定方法。但是SSR分子标记由多对引物共同鉴别，其鉴别结果更加可靠，此外SSR分子标记还可以对物种的遗传特征进行分析，附加更多的研究价值，如黄平通过SSR 分子标记鉴定了44 个月季品种，并对参试品种进行了表型关联、遗传距离等多项遗传分析。邱英雄通过SSR分子标记，不仅获得川明参一个特有的分子鉴定标记，还对明党参和川明参的系统发育关系进行了探讨。因此，黄芪与红芪SSR分子标记值得研究。
4 结论
笔者通过SSR分子标记技术，筛选用于黄芪与红芪鉴定的核心引物，通过聚类分析结果确认引物的有效性和准确性，标记核心引物的特异性位点，生成鉴定图谱代码，为黄芪与红芪的鉴定及遗传分析提供了依据。
参考文献（略）
厚毅清，石有太，张艳萍，刘新星，陈玉粱：甘肃省农业科学院生物技术研究所