花药和小孢子培养
花药和小孢子培养均是以雄核发育途径产生单倍体的培养方法。花药培养是人们在单倍体诱导技术中最早开展研究的方法，也是迄今为止应用于育种实践最成功的单倍体育种技术，尤其在小麦、水稻这两种重要农作物中的研究和应用居多；小孢子培养技术是在花药培养技术的基础上发展起来的，由于其更具优势，近年来得到快速发展，在大麦、油菜等作物中较为成功，目前已成为单倍体育种技术中的研究热点之一。就操作技术和方法而言，花药培养属于器官培养的范畴，而小孢子培养则属于细胞培养范畴。
1.花药培养技术操作过程简述
花药培养一般是指将处于一定发育阶段的花药经过一定预处理，之后在无菌状态下接种于培养基上，改变其发育方向，使其不形成配子，而是如体细胞一样分裂分化，最终形成再生植株。花药培养操作过程主要分为花药的脱分化培养和再分化培养，即首先诱导分化为愈伤组织或胚状体，之后再分化为再生植株，一些植株在此过程中染色体已经得到自发加倍，如自发加倍率低时可进行人工加倍，从而形成加倍单倍体。从具体操作来说，主要分为供试材料种植、采穗/蕾、接种、愈伤组织/胚状体诱导、绿苗分化、生根壮苗、染色体加倍、炼苗移栽等。以小麦为例，花药培养的流程一般如图5-2所示：
图5-2 小麦花药培养技术流程
（1）杂交亲本的选择
不同基因型材料的花药培养力差异极大，一些材料几乎诱导不出愈伤组织或胚状体，而另外一些材料的诱导率则可以达到比较高的水平，可见花药培养具有较强的基因型依赖性。因此在杂交亲本的选择上，除了常规育种中对亲本的要求之外，还应注意亲本之一至少要选择那些具有良好的花药培养特性或高花药培养力的材料。因此，在花培育种中，筛选高花药培养力的亲本材料是一项重要的基础性工作。
（2）供试材料的种植和管理
供试材料可种植于田间、温室或人工气候室。田间种植的材料由于环境条件不稳定，对花药培养效率的影响较大，温室次之，人工气候室中最佳。但由于人工气候室花费较大，对大部分育种单位来说并不现实，因而目前绝大部分花药培养的供试材料均种植于田间。所有用于花药培养的供试材料在生长阶段一定要认真细致管理，及时足量施肥、浇水，并预防倒伏和病虫害。此外，在花培育种中，由于接种时间较为集中，工作量较大，短期内会对工作人员形成较大压力，因此可在田间或温室进行分批种植以增加接种的数量和规模。
（3）培养基的配制
在花药培养中，诱导花药组织脱分化形成愈伤组织或胚状体的培养基称为脱分化培养基或诱导培养基。培养基的配制方法与其他植物组织培养相同，即需要将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分等先配制成不同倍数的母液，贮藏于4 ℃冰箱保存；在接种前2～3 d按规定量及不同倍数进行稀释配制培养基，培养基的pH值一般调为5.8左右；配制好的培养基经高温灭菌后置于常温下放置1～3 d后进行接种。
（4）取材与镜检
取材时要选取健康旺盛、无病虫害的植株上的花蕾或穗子。小孢子细胞发育时期一般分为四分体时期、单核早期、单核中期、单核末期（也称为单核靠边期）、双核期以及成熟花粉粒时期。采集的花药需要进一步做镜检，以确定其中小孢子的发育时期。国内外的研究表明，大部分植物花药中小孢子发育时期处于单核中期至双核早期时较为适宜进行花药培养，可能是因为这一时期小孢子细胞的活动较为活跃，且处于胚胎形成的临界期，也是不同分裂方式及发育途径的共同起点。
在完全没有花药培养的经验时，需在前期做小孢子发育时期与外部形态一致性的研究以便于取材。小孢子发育时期的细胞学观察方法如下：每组随机取10 个花蕾或5 个穗子，将花药用镊子取出置于卡诺氏固定液中（冰醋酸∶纯酒精=1∶3）固定24 h，转至70%酒精中，于0～4 ℃冰箱中保存。制片时，取出花药置于载玻片上，轻轻挤压花粉涂抹到载玻片上，去除花药壁等较大的杂质，滴1%的醋酸洋红液染色1～2 min，盖片，烤片，压片，制成临时制片，即可在显微镜下观察细胞形态结构，从而确定其所处的发育时期。
（5）预处理
预处理是诱导小孢子细胞由原来的发育途径（配子体发育途径）向孢子体发育途径转变的重要因素之一。适宜方式的预处理能够极大提高花药培养的成效。因此，在进行花药培养之前，一般还要对材料进行一定方式的预处理。尽管不同的植物材料预处理的效果不尽相同，但目前最常用的预处理方式主要有高温（30～33 ℃）、低温（4～7 ℃）、饥饿（甘露醇）等，其中在大部分植物中以低温预处理最为方便，也比较有效。
（6）表面消毒与接种
接种到培养基上的花药必须保证完全无菌，否则会导致污染而使得培养彻底失败。在对无外围组织包裹的花药进行消毒时，需要注意用较为柔和的消毒剂，如次氯酸钠等；而对外围组织包裹的穗子和花蕾进行消毒时，根据不同材料可用较为强力的升汞、75%酒精等，由于这两种消毒剂对外植体的损害较大，因此在时间上一定要掌握好，一般0.1%的升汞消毒不超过10 min，75%酒精消毒不超过1 min，无菌水冲洗干净后进行接种，接种时要轻轻地操作，以免损坏花药，并彻底去除花丝，从而减少或排除花药壁或花丝产生体细胞的二倍体愈伤组织。
（7）脱分化培养（愈伤组织/胚状体诱导培养）
花药愈伤组织或胚状体的诱导一般需要在接种后进行7～10 d 高温暗培养（28～33 ℃），之后转入22～25 ℃进行光照或暗培养。一般在10～20 d后花药开裂产生愈伤组织或释放出胚状体，一部分植物如胡萝卜等在此过程中需要更换培养基（主要是去除2,4-D等激素），并转接愈伤组织或胚状体1～2次，以利于更好地分化出绿苗。
（8）分化培养
待形成的愈伤组织或胚状体直径1～3 mm时转入再生培养基以分化形成苗。一些植物可以一次性完成芽和根的分化（如小麦、大麦等），而其他一些则需要分段进行（如油菜、胡麻等）。
（9）染色体加倍处理
对自发加倍率比较低的物种，再生苗还需要利用药物处理等方式来达到染色体加倍的目的。一般采用秋水仙素在移栽前或分蘖期浸根或浸泡的方法，不同材料处理的时间也不尽相同。
（10）炼苗和移栽
组培室所获得的再生苗需要炼苗以适应移栽后的环境，再生苗的移栽技术是规模化育苗的关键技术之一，盲目移栽或稍有不慎，就会造成大批苗的死亡。因此要不断完善移栽技术，提高炼苗效率。一般采用清水炼苗或在移栽后的环境中（如温室）打开瓶口敞开3～7 d，然后进行移栽。
2.影响花药培养的因素
供试材料的基因型、培养基类型及成分、花药中小孢子发育时期、预处理方式、接种密度、白化苗的分化频率、花培苗的越夏、单倍体植株的加倍以及这些因子之间的互作等均可对花药培养效果产生重要影响。其中以下几个因素最为关键：
（1）基因型依赖性
从最初花药培养研究开始，人们就注意到了不同基因型材料的花药培养力差异极大，一些材料几乎诱导不出愈伤组织或胚状体，而另外一些材料的诱导率则可以达到比较高的水平，此后大量的研究均证明了几乎在所有物种的花药培养中均存在基因型依赖性问题。这也是花药培养目前最大的限制因素之一。
（2）脱分化培养基类型(https://www.daowen.com)
不同植物适宜于花药培养的诱导培养基并不相同。花药培养中氨基态氮较一般组培中要偏低。在禾本科植物小麦、大麦、水稻等作物中，诱导培养基一般用N6、W14、C17、马铃薯培养基、癸培养基等；在十字花科植物油菜、白菜、甘蓝等作物中，一般用B5 或NLN13 等；而在其他一些植物中，MS 培养基也有较多的应用。许多研究表明，愈伤组织或胚状体的诱导效果在液体培养基上要优于固体培养基，但其分化则往往较差，原因可能在于愈伤组织在形成后会沉入培养瓶底部受到“淹害”所致。为防止愈伤组织沉底，可将高分子量聚合物Ficoll加入液体培养基中，也可以采用固液双层培养基。
（3）供试植株的生理状态
供试植株的生理状态直接影响其花药组织内的内源激素水平和营养状态，进而决定花药培养的成效。而供试植株的生理状态则又由其生长环境所调控，如种植环境中的温度、光照强度及光周期、湿度、土壤中的营养成分等诸多因素。大量研究表明，取材于田间种植的材料，受季节影响极为显著。尽管不同植物所适宜的生长环境不同，但目前一般认为，在冬春季较夏秋季取材更适合于进行花药培养，并且生长在较低温度下的供试植株（12～18 ℃）以及年幼的植株，其花药易于诱导形成愈伤组织或胚状体。
3.小孢子培养
小孢子培养是指将植物花药中一定发育阶段的小孢子细胞从花药中分离并纯化出来，接种到浅层液体培养基上进行培养，使小孢子启动脱分化过程，再经分化培养，进而发育成完整植株的一种技术。相对于花药培养，小孢子培养是在细胞水平上的操作技术，因此其对培养条件的要求更为严苛，过程更为烦琐。
（1）小孢子培养的优势
小孢子培养较其他单倍体诱导技术具有以下明显的优势：
①游离小孢子培养主要是通过胚状体途径发育成植株，避免了愈伤组织阶段，因而成苗率高，在较短时间内可获得大量重组纯合系，使得所有性状得到表达，可直接进行农作物新品种选育或作为优良亲本间接应用于品种改良，也可进行有关性状的分子标记研究，大大缩短了因自交纯合所需时间，提高了育种效率，节省了人力、物力和财力。
②游离小孢子（或由小孢子起源的胚状体）是转基因的良好受体材料，一旦获得转基因材料后（或者转基因材料经小孢子培养），经一代即可获得转基因纯系进行基因功能分析，从而提高研究工作效率。
③由于从花药中分离获得的游离小孢子是单倍体单细胞，具有与单细胞微生物系统相似的所有优势，加上小孢子胚胎发生和植株再生能力强，因而能用于胚胎的克隆和新基因型或突变体的大量快速繁殖。
④游离小孢子培养能产生大量一致的胚状体，这些胚状体与合子胚的生长发育极为相似，为人工种子的开发提供了新途径，而且能被广泛应用于胚胎发育的生理生化研究，以及胚胎生长过程中如蛋白质、脂肪酸积累等的动态研究，便于品质性状的早期选择。
⑤冷冻游离小孢子及其胚状体仍保持较强的胚胎发生能力和植株再生能力，因而可作为种质资源保存的替代途径。
⑥分离后的游离小孢子具有较强的胚胎发生能力和植株再生能力，因而是进行突变诱导和突变体产生的理想途径。
（2）小孢子培养的技术要点
小孢子培养除了增加小孢子细胞的分离纯化外，其余过程与花药培养基本相同。此外，由于小孢子细胞无花药壁与培养环境的缓冲，因而对所处的环境条件（培养基成分、预处理方式、培养环境等）尤为敏感。国内外的研究表明，供试材料的种植环境、预处理方法、培养基等因素在提高小孢子培养效果方面具有重要作用。
①小孢子细胞的分离纯化方法
主要有自然释放法、研磨过滤法、剖裂释放法等。
自然释放法：把花药表明消毒后，在无菌条件下取出花药，置于培养基上进行培养，花药自然开裂，就会将花粉散落在培养基上，然后去掉花药壁等其他组织再进行培养。这种方法早期采用较多，缺陷是收集到的小孢子细胞数量相对较少，因此目前使用较少。
研磨过滤法：将花药表面消毒后，在无菌条件下放入含有分离液的研磨器中研磨，使得花粉（小孢子细胞）释放出来，然后通过一定孔径的筛网过滤，离心收集，然后进行培养。这是目前大多数小孢子培养过程中所采取的方法。
剖裂释放法：这种方法需要借助一定工具将花药剖开，使得花粉（小孢子细胞）释放出来，这种方法在烟草等植物中有较为成功的应用，但显然较第一种方法更为费时费力。
②预处理
启动小孢子细胞胚胎发生途径，预处理是关键因素之一，适宜的预处理方式能够大幅提高小孢子胚胎发生能力。基于目前的经验，人们认为要有效启动小孢子胚胎发育过程，必须给予一定的胁迫处理，不同的植物种类，甚至同一植物小孢子不同的发育阶段，所需的胁迫方式也有所不同，最常用的为温度（冷或热）、饥饿（糖饥饿或氮饥饿）、化学药物（秋水仙素、乙醇等），表5-3列出了一些植物小孢子培养中所采用的预处理方法。
表5-3 用于部分植物小孢子培养中的预处理方式
③有机添加物
在培养基中添加某些植物器官组织或有机添加物能够有效提高小孢子胚胎的产率。在小麦、大麦等作物的小孢子培养中，一般在培养基中加入未成熟子房预培养或与小孢子共培养。此外，培养基中加入AGP（酸性糖蛋白）、脯氨酸和谷氨酰胺等有机添加物具有良好的效果。
④种植环境
供试材料可种植于田间、温室或人工气候室。由于田间环境的不可控性，而供试材料的生理状态对小孢子培养的效果具有重要作用，能否收集到足量的、有活力的且发育同步化较高的小孢子细胞是小孢子培养获得成功的关键因素之一。人工气候室由于可实现对光照、温度、湿度等环境的人为控制，可进行一个环境因子的不同处理试验且不受季节性影响，因此被普遍用于小孢子培养研究中，尤其在建立小孢子培养再生技术体系的初期非常重要。
⑤培养基
小孢子培养中一般均采用液体培养基，培养基一般需要过滤灭菌。植物种类不同，培养基类型也各异。小麦小孢子培养中一般采用MMS、CHB 培养基，大麦普遍使用FHG、N6培养基；油菜等十字花科植物则普遍采用NLN、B5培养基。