花粉管通道法操作技术及转化机理
1.操作技术
花粉管通道法是指在植物授粉后，花粉在柱头上形成花粉管通道，采用微量注射或柱头切除滴加等方法，在通道关闭前适当的时期，通过花粉管将外源DNA 导入胚囊，转化其受精卵或配子细胞。
在外源DNA转化中，主要采用的方法有：
（1）自花授粉后导入法(https://www.daowen.com)
自花授粉后导入法是使用最多的一种方法，即将供体总DNA 片段在受体自花授粉后适当的时期滴加在柱头上，使其沿着花粉管通道进入胚囊，实际应用时一般先切除柱头。这样可缩短通道距离，提高转化效率。黄骏麒等（1986）首次利用此法，成功地将外源海岛棉DNA 导入陆地棉，培育出抗枯萎病的栽培品种，随后倪建福等（1994）、王亚馥等（1995）成功地将此法用于小麦的转化，将高粱DNA 导入普通小麦，选育出抗条锈病白粒新品系。
（2）花粉匀浆涂抹柱头法
以花粉携带外源DNA 的原理，将来源不同的花粉进行匀浆处理后直接涂抹柱头的方法，张孔渐等采用此法成功地进行了恢复可育转移（Zeng et al，1998）。
（3）采用花粉管直接携带法
在开花前将受体植株去雄套袋，以防止其先行授粉，待开花后用供体DNA 或花粉均匀处理该受体植物柱头，处理毕，待5 min 后授以受体植株正常花粉，以使其供体外源遗传物质随花粉管的生长而导入受精卵。刘根齐等（1994）用该方法选育出在新疆大面积推广的75（918）改良新品系，在保持原有优良性状的基础上籽粒由红粒改良为白粒，提高了小麦的商品性能。
（4）受体花粉与供体DNA混合授粉法（Hess，1980）
根据导入外源DNA 的携带形式可分为三个转化系统，即载体转化系统、直接转化系统和种质转化系统。载体转化系统是将目的基因插入农杆菌质粒或病毒的DNA 序列上，在载体DNA 的携带下进行转化，随着基因克隆和功能表达研究的深入，这种系统成为发展的主要趋势；直接转化系统是将裸露的DNA 直接用于转化，一般是目的基因片段或基因组DNA；种质转化系统是借助花粉携带遗传物质的现象采取的一种转化方法。
2.转化机理的研究和探讨
花粉管通道法自提出以来，在较长的一段时期内尽管在性状方面的确发生了明显的变异，但由于缺少确切的分子证据而遭到人们的质疑，并且有人称之为“中国式的转基因技术”。龚蓁蓁等（1988）用同位素示踪法表明通过3H标记的棉花DNA（50 kb）经珠孔进入开放的珠心到达胚囊，30 min 后即观察到胚囊中3H-DNA 自显影，80%以上的胚囊2～4 h均有外源DNA 进入，除从珠孔到胚囊间的花粉管通道外，珠心的任何其他部位和进入胚囊的花粉管内均无自显影斑点，说明花粉管的珠心通道是DNA 从珠孔到达胚囊的唯一途径。邓德旺等报道，采用激光聚焦显微镜观察到花粉管从花粉进入中轴胎座时，需要经过一个折向沿中轴的外周向上生长，在胚珠着生处再折向进珠孔，外源DNA 经过胎座上传输组织中的花粉管外缝、胎座表面、珠孔、珠心通道进入胚囊，直接转化处于融合时期的无壁生殖细胞。把外源基因导入的途径确立为花粉管外通道而非花粉管内通道，转化受体确定为融合期的生殖细胞而非受精卵、早期合子细胞等，这个观察结果与先前假说不同，更具有科学性，且有分子细胞试验结果的支持。
Luo 和Wu（1988）首次报道用花粉管通道法将含报告基因的质粒DNA 转入水稻，经Southern 杂交和酶学测定证明，得到了外源基因整合并表达的转基因水稻植株。这使花粉管通道法的转化工作像其他转化法一样，可以完全按转基因技术操作。接着曾君社等（1993）、Chong和Tan （1995）报道了用该法转化小麦，经过筛选、Southern、Northernblot鉴定以及对表达产物的检测，获得了小麦的转基因植株。至此，花粉管通道法已在多种作物中获得成功，确定了其在直接转化法中的地位。
Potrykus（1990）著文将受体组织的细胞分成8种状态。并认为此8种状态中同时具备再生感受态和转化感受态的细胞，才是转化成功至关重要的。关于这类细胞的特征，有人认为，要想使细胞恢复全能性，必须消除细胞以前的分化程序，使之呈脱分化状态，那么这种细胞对外源基因的导入是感受的（Ronchi et al，1994）。对脱分化细胞的形态描述看，大多是指细胞核大、原生质浓厚、液泡化程度低的类似分生组织的细胞，用这种标准分析受精过程发生时的精卵接合和合子形成，就会发现分化程度很高的卵细胞在同精子接触的一刻开始，发生急剧的脱分化过程，受精后形成合子，彻底消除了以前的分化特征，变成核大、质浓和分裂活跃的细胞，具有上述再生及转化感受态细胞的特点，花粉管通道法正是利用这一特点，如在此时将外源DNA 引入花粉管内，则有机会参与受精过程，达到转化的目的。因此花粉管实际上是起着运载外源DNA 的作用。所以这种方法也可以称为花粉管运载法。
细胞学观察证明，在小麦、黑麦、大麦、水稻等禾本科及棉花、向日葵、豌豆等农作物中，受精过程发生时常有多个花粉管进入胚囊的现象（曾君社等，1993），近年来亚显微结构的观察揭示，在精子进入时，卵细胞的细胞壁还未形成，一些胞壁物质分散地聚集在细胞膜的表面似小岛状（Zhu et al，1993）。因此这时的卵细胞类似未完全酶解的原生质体，为外源基因的进入提供了可能性，何况在精子进入卵细胞的过程中，也为其他内含物的进入提供了机会，因此我们认为这一方法的转化原理同原生质体的转化相似。李忠杰等（1995）研究表明外源DNA经射线辐照后，引起了DNA链断裂和碱基对破坏，断裂的DNA相对分子质量小，导入受体后易于整合，整合后染色体又容易配对，这可能是辐照引起诱导率提高的原因，由此可以推测适当长度的DNA 片段是提高转化效率的因素之一；同时质膜和核膜很容易在生物自由基的作用下受到损伤，为小片段DNA 进入卵细胞创造了条件，这也是辐照提高诱导率的原因之一。冀俊丽等（2002）研究发现，采用负压处理可以提高转化效率，因此，可以采用理化的手段来提高转化效率。基因在花粉管通道法导入后能传递给下一代，从表型看有时不遵循孟德尔遗传规律，并且存在基因沉默现象，这是由于DNA 碱基被甲基化造成的，也可能由于整合位置不合适而受抑制，导致不表达；同一质粒上的两个基因可以不同时表达，表现出基因表达的独立性，外源基因拷贝数随世代增高而降低，上一代表达量不高的植株，后代中外源基因仍然有高的表达概率（Zeng et al，1998）。