转基因植株外源基因纯合和嵌合基因体检测
1.转基因植株外源基因纯合体检测
转基因作物在全世界已广泛种植，在转基因植株的利用中，外源基因的快速纯合是育种利用的必要前提。因此，区分转基因后代植株是杂合体还是纯合体很有必要。在遗传学中，纯合体又称同型合子或同质合子，是指由两个基因型相同的配子所结合而成的合子，也指由此种合子发育而成的生物个体。纯合体的同源染色体，在其对应的一对或几对基因座位上存在着完全相同的等位基因，如AA、aa、AABB、AAbb、aaBB、AABBcc、aaBBcc等，具有这些基因型的生物，就这些成对的基因来说，都是纯合体。在它们的自交后代中，这几对基因所控制的性状不会发生分离。
杂合体又称异型合子或异质合子，是指由两个基因型不同的配子结合而成的合子，也指由此种合子发育而成的生物个体。杂合体的同源染色体，在其对应的一对或几对基因座位上存在着不同的等位基因，如Aa、AaBb、AaBbCc 等，具有这些基因型的生物，就这些成对的基因来说，都是杂合体。在它们的自交后代中，这几对基因所控制的性状会发生分离。
根据外源基因插入位点已知与否，纯合体的鉴定方法并不相同。首先介绍在不清楚外源基因插入位点的情况下如何鉴定转基因植株外源基因是否纯合。
（1）插入位点未知的纯合体鉴定
1）筛选剂及PCR鉴定纯合体
根据遗传分离的原理，可采用常规PCR检测方法进行纯合体的鉴定。常规的方法是对T0代（转基因当代）转化体自交获得Tl代转基因植株，然后对每个独立分离的T1代转基因植株产生的T2代个体进行转基因分离比率的研究。通常采用PCR方法鉴定出T2代不再分离的转基因株系（不再出现不含目的基因植株的株系），被鉴定为纯合的转基因株系。如果一个T1代PCR 阳性株所产生的T2代幼苗发生转基因分离且分离比率明显偏离3∶1，就表明在转基因植株中存在2 个或多个不连锁转基因拷贝，而且都为杂合状态。王立光（2014）利用该方法获得了拟南芥转AtNHX5及AtNHX6的纯合体。
由于标记基因与目的基因紧密连锁，因此可采用简单的标记基因检测来替代目的基因的检测。基于抗生素—筛选标记基因等建立的抗生素筛选体系简单、直观、省时，适用于对转基因纯系种质的筛选，对转基因亲本与杂交组合纯度的检测同样具有指导意义。首先需确定筛选剂的最佳筛选浓度，一般为最低剂量，以确保可以达到筛选效果；其次确定最佳筛选时期和处理时间，以有明显表型为宜；然后确定评价的表型标准；最后利用普通PCR检测作为辅助手段，对抗性植株进行检测，以明确该筛选剂的准确性及筛选压力，并将抗性筛选与PCR检测进行符合度比较。
2）定量PCR法鉴定纯合体
常规的筛选转基因纯合体方法通常耗时费力，而且浪费了许多宝贵的T1代转基因材料。荧光定量PCR 已成为一种快递、简单、有效的纯度鉴定方法。沈亚欧等基于SYBR Green I染料荧光定量PCR 技术建立了在不依赖已知目的基因插入位点及侧翼序列的情况下，快速、简易地鉴定出转基因玉米纯合体的早代鉴定方法。该方法的依据为：T1代单拷贝转基因株系中杂合体和纯合体最本质的区别是，在杂合体中目的基因只存在于同源染色体中的一条染色体，而纯合体中目的基因则同时存在于同源染色体中的两条染色体，即纯合体中目的基因含量是杂合体中的2 倍。这种差异可以被基于SYBR Green I 染料的荧光定量PCR技术灵敏地检出。流程如下：
a.提取待测T1代转基因植株DNA；
b.选择参照基因、设计目的基因和参照基因的PCR引物；(https://www.daowen.com)
c.用普通PCR方法对阳性T1代转基因植株进行预检测；
d.证明基因特异扩增，获得基因扩增效率；
e.计算目的基因在各T1代植株中的相对含量；计算公式如下：
f.检出转基因玉米纯合体，当目的基因相对含量约等于1 时，该植株为纯合体，当基因相对含量约等于0.5时，该植株为杂合体。
（2）插入位点已知的纯合体鉴定
如果外源基因在遗传转化过程中未发生重组，并且插入位点在植物基因组中已知的话，可利用复合PCR 方法筛选鉴定纯合体植株。该方法为转基因植物育种提供了筛选纯合体的方法，可提高转基因植株的利用效率。多重PCR （multiplex PCR）首先由Chamberlain 等提出，是在同一PCR 反应体系里加入两对以上引物，针对多个DNA 模板或同一模板的不同区域进行扩增，以满足同时分析不同DNA 序列的需要。张焕春等（2012）利用多重PCR 组合四对引物，建立了筛选转Cry1Ab 水稻纯合体的鉴定方法。具体的检测分为以下几步：
1）确定基因组DNA 和T-DNA 边界序列，在T-DNA 左边界侧翼序列设计左翼引物G11F，在T-DNA 序列右边界侧翼序列设计右翼引物G11R，插入片段T-DNA 分别设计上、下游引物5-P 和3-P。
2）待测材料内参基因扩增，用于排除由于DNA 质量以及操作等因素对检测结果可靠性的影响，避免假阴性结果的发生。
3）利用G11F、G11R、5-P 和3-P进行多重PCR，根据PCR 扩增条带数和条带的大小来鉴定转基因植株的纯合体。
2.转基因植株外源基因嵌合体检测
遗传学上嵌合体指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。根据转基因的方法不同，嵌合体产生的比例也各不相同。通常转化的受体组织为单细胞或分化程度较低的转基因材料，嵌合体的比例相对较低；而多细胞或分化程度较高的组织来源的再生转基因材料，嵌合体的比例较多。嵌合体的检测多采用PCR的方法，即对转基因植株不同组织部位进行检测。需要指出的是，对于嵌合体的植株，T0代检测阴性的植株并不代表其是非转基因植株，尚需对其后代进行检测，仍有较低阳性率的后代。