基于限制性酶切和PCR技术的DNA分子标记
基于限制性酶切结合PCR扩增技术的DNA分子标记，包括扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）和酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS）等。AFLP 是由荷兰科学家（Vos et al，1995）创建的新型分子标记技术，是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）的基础上发展起来的DNA 多态性检测技术，具有RFLP 技术高重复性和RAPD 技术简便快捷的特点，无须制备探针，且与RAPD 标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD 技术重复性差的缺陷。与其他以PCR 为基础的分子标记相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。近年来，AFLP技术获得了很大进步，并展示出良好的发展前景，已经广泛应用于生命科学研究的诸多领域，如动物学、植物学、医学等方面。
1.AFLP标记技术的原理（见图6-4）
AFLP 技术是基于PCR 反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA 大小不同，基因组DNA 经限制性内切酶切割后，形成分子量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人工合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3′端选择性碱基的识别，对特异性片段进行预扩增和选择性扩增。只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增，最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。
图6-4 AFLP标记的原理及分析流程示意图
A.基因组DNA酶切；B.选择性扩增酶切片段；C.AFLP标记的检测
2.AFLP标记技术的方法步骤
AFLP 分子标记技术包括3 个步骤（周延清，2005；侯雷平等，2010）：首先是制备高纯度基因组DNA，即DNA 的酶切以及与人工合成的寡聚核苷酸接头（artificial oligonucleotide adapter）连接，为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用双酶酶切，在基因组上分别产生低频切口和高频切口；其次是选择性扩增酶切片段，AFLP 引物包括与人工接头互补的核心序列（CORE）、限制性内切酶识别序列（ENZ）和3′端选择性碱基三部分，一般用不带或带1个选择性碱基的引物进行预扩增，然后用带2～3个选择性碱基的引物进行再扩增；最后是AFLP 标记的统计，AFLP 产物通过聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）检测样品的多态性，可灵敏地分辨只有1个碱基差异的不同DNA片段。
（1）DNA制备
AFLP 技术成功的关键在于DNA 的充分酶切，所以对模板质量要求严格，分离到高质量的基因组DNA 至关重要。基因组DNA 260/280的值应为1.8左右。在制备DNA 的过程中要特别注意避免其他DNA污染和抑制物质的存在。
（2）酶切
进行AFLP 分析时，一般采用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA 进行酶切，一种为低频剪切酶，识别位点为六碱基的rare cutter（常用EcoRI、PstI 或SacI）；另一种为高频剪切酶，识别位点为四碱基的frequent cutter（常用MseI、TaqI）。双酶切产生的DNA 片段长度一般小于500 bp，在AFLP 反应中可被优先扩增，扩增产物可被很好地分离，因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶搭配使用的双酶切。常用的两种酶是4 个识别位点的MseI 和6 个识别位点的EcoRI。经过酶切后就形成了三种类型的酶切片段，如EcoRI/MseI 酶切形成EcoRI—EcoRI 片段、EcoRI—MseI 片段、MseI—MseI片段。
（3）连接
酶切后的DNA 片段在T4 DNA 连接酶的作用下，与两种内切酶相应的特定接头相连接，形成带接头的特异性片段。接头（Artificial adapter）为双链，一般长14～18 个碱基对，由一个核心序列（Core sequence）和一个酶特定序列（Enzyme-specific sequence，能与酶切片段粘端互补）组成。通常在酶特定序列中变换了一个内切酶识别位点的碱基，保证了连接片段不能再被酶切。只有遵循“引物扩增原则”设计的接头才能得到满意的扩增结果。
（4）PCR扩增
应用与接头相识别的引物进行扩增。AFLP 引物由三部分组成：5′端的与人工接头序列互补的核心序列（core sequence）、限制性内切酶特定识别序列（enzyme-specific sequence）、3′端的带有选择性碱基的黏性末端（selective extension）。其中AFLP 接头的设计（包括核心序列和酶特定序列）是关键之处，常用的多为EcoRI和MseI接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点，合成的寡核苷酸接头经过94 ℃变性，37 ℃退火，4 ℃保存备用。理论上每增加一个选择性碱基，将只扩增限制性片段的1/4，而在两个引物上都有三个选择性碱基的情况下，则仅获得1/4096的片段。也就是说，只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增，所以选择性碱基是选择用于扩增的特定的限制性片段的一种精确而有效的方法。
AFLP 标记中PCR 扩增包括预扩增（Pre-amplified）和选择性扩增（Elective amplified）。预扩增所用引物3′端有1个选择碱基，通过预扩增对扩增模板进行初步筛选，一方面可以避免直接扩增造成的指纹带型背景拖尾现象，另一方面可以避免直接扩增由引物3′端3个选择碱基误配形成的扩增产物。预扩增产物经稀释后进行选择性扩增，使所需模板量不受限制。所用引物3′端有3 个选择碱基的延伸，通过3 个选择碱基的变换获得丰富的DNA片段。
（5）检测方法
随着检测技术的不断提高，同位素标记是早期检测AFLP 的一种方式，之后被荧光标记取代，灵敏度虽高但成本昂贵，地高辛标记相继出现，大大降低了同位素的危害性，同时荧光标记技术也由单纯标记引物转变为标记d NTP。扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺胶（厚0.5 mm）和1×TBE 电泳缓冲液电泳分离（BIO-RAD 公司测序电泳仪），用银染技术检测PCR产物，方法与SSR检测方法相同。
（6）数据分析
多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。用BIO-RAD 公司的Quantity One 软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。
3.AFLP标记的技术特点
（1）分析所需DNA 量少，一个0.5 mg 的DNA 样品可做4000 个反应，AFLP 对模板浓度的变化不敏感，DNA 浓度在1000 倍的范围内变化时对反应的影响不大，所产生的指纹图谱十分相似。但AFLP对模板DNA的质量要求较为严格，DNA的质量影响酶切、连接扩增反应的顺利进行。
（2）结果稳定可靠，重复性好。AFLP 分析采用特定引物扩增，退火温度高，使假阳性降低，可靠性增高。
（3）多态性高。AFLP 分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，理论上AFLP 可产生无限多的标记数并可覆盖整个基因组。每个反应产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到的标记数为50～100个，能够在遗传关系十分相近的材料间产生多态性，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。
（4）样品适用性广。AFLP 技术适用于任何来源和各种复杂度的DNA，如基因组DNA、cDNA、质粒、某一个基因或基因片段，且不需要预知这些DNA 的序列特征。用同样一套限制酶、接头和引物，可对各种生物的DNA进行分子遗传标记研究。
（5）遗传稳定性好。AFLP 标记在后代中的遗传和分离中符合Mendel 式遗传规律，种群中的AFLP标记位点遵循Hardy-Weinberg平衡。在技术特点上，AFLP 实际上是RAPD和RFLP 相结合的一种产物。它既克服了RFLP 技术复杂、有放射性危害和RAPD 稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点，同时又兼有两者之长。近年来，人们不断将这一技术完善、发展，使得AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子标记之一。
4.存在的问题及其对策
AFLP 技术虽然是对生物基因组进行分析的一种较为理想的方法，但也存在不足之处。AFLP 标记的不足之处在于步骤烦琐、费时、所需实验试剂及设备费用仍较高，操作技术难度大等。如AFLP技术对DNA纯度要求很高，需要高质量、高纯度的DNA，由于其灵敏度高，微量的DNA 污染可以导致很大的偏差等；AFLP 试验步骤烦琐，涉及试验试剂多，极易造成试验体系不稳定而导致试验失败，所以酶切、连接、预扩和选扩试验严格规范操作；试验中所用到的酶、接头和引物要防止污染和降解。基因组的不完全酶切会影响试验结果，因此，试验如果失败应首先从酶切开始分步设置对照寻找原因。