半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究[2]
凝集素是一类可逆的结合特异单糖或寡糖的蛋白质，部分具有杀虫作用。目前研究较多且成功用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有雪花莲凝集素（GNA）基因、豌豆凝集素（P-Lec）基因、麦胚凝集素（WGA）基因和半夏凝集素（Pinellia Ternate Agglutinin，PAT）基因。其中，半夏凝集素基因是一类广泛用于提高植物抗蚜性的凝集素基因。本研究所用的外源半夏凝集素基因克隆自甘肃省西和县半夏无菌苗，转半夏凝集素基因烟草株系的蚜口密度抑制率最高达89.4%，抗蚜效果显著。但关于半夏凝集素基因转化小麦的研究很少见报道。因此，本研究将半夏凝集素基因转入甘肃省的两个小麦品种（系）中，初步建立了农杆菌转化体系，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 植物材料及幼胚预培养
研究所用的春小麦品种陇春22和品系9614由甘肃省农业科学院生物技术研究所提供。供试材料开花后14～16 d 剪取麦穗，剥出籽粒，70%乙醇浸泡1 min，20% NaClO 溶液表而灭菌15 min，无菌水冲洗3遍，分离出幼胚，盾片一而朝上接种在PIC1愈伤组织诱导培养基（MS附加500 mg·L-1谷氨酸、1950 mg·L-1乙磺酸、100 mg·L-1水解酪蛋白、100 mg·L-1维生素C、4%麦芽糖、2 g·L-1植物凝胶、2 mg·L-12,4-D）中，24 ℃黑暗条件下诱导愈伤组织。
1.2 农杆菌菌株及培养
农杆菌菌株C58c1 由美国内布拉斯加大学生物技术中心提供。用于转化的质粒pBIpta（图1）携带由CaMV3S 启动子驱动的pta 基因（半夏凝集素基因），nptⅡ基因为选择标记基因。将农杆菌划线培养在含Kan 50 mg·L-1，rif 50 mg·L-1、Str 50 mg·L-1、Genta 50 mg·L-1的YEP 固体培养基中，28 ℃避光培养2 d后挑选单菌落接种到含相同抗生素浓度的YEP 液体培养基中，28 ℃，250 r.min-1避光振荡培养。
图1 pBI pta 质粒结构简图
Fig.1 General frame of plasmid pBIpta
图2 胚性愈伤组织的诱导
Fig.2 Transgenic embryogenic
1.3 愈伤组织与农杆菌的共培养
将达到对数生长期的菌液倒入一无菌离心管中，室温下5000 r.min-1离心5 min，收集的菌体用重悬培养液（1/10MS 附加500 mg·L-1谷氨酸、1950 mg·L-1乙磺酸、100 mg·L-1水解酪蛋白、100 mg·L-1维生素C、1%葡萄糖、2 mg·L-1 2,4-D 200 μmol·L-1乙酰丁香酮）重悬，再离心收集菌体，用重悬培养液稀释使菌液OD600值等于0.6左右。将预培养4 d的幼胚愈伤组织用农杆菌侵染30 min，共培养3 d。
1.4 愈伤组织的选择与植株再生
共培养结束时，将侵染过的愈伤组织转接至含500 mg·L-1 Carb的PIC1愈伤组织诱导培养基中，24 ℃暗培养15～20 d。然后转接到PIC2 愈伤组织诱导培养基（除2,4-D 为0.5 mg·L-1外，其余成分与PIC1培养基相同）中。20 d继代一次，其间挑选生长良好的胚性愈伤组织（见图2）转接到添加有500 mg·L-1Carb的PR分化培养基（N6附加1950 mg·L-1 MES、100 mg·L-1 维生素C、4%麦芽糖、2 g·L-1 Phytagel、0.2 mg·L-12,4-D）中进行分化培养（图3），16 h（24 ℃）/8 h（20 ℃）光照培养。当分化苗长至2～3 cm 时，转接至含300 mg·L-1 Carb、25 mg·L-1 G418的1/2MS培养基中进行生根培养，并筛选抗性苗。
图3 愈伤组织的分化
Fig.3 Regeneration of transgenic embrvogenic calli
1.5 转化植株的PCR分子检测
获得G418（25 mg·L-1）抗性植株21 株，分别提取基因组DNA。以抗性植株基因组DNA 为模板，以pta 基因引物为特异引物进行PCR 扩增，以检测抗性植株中目的基因pta的整合情况。PCR 引物序列为：F 5′-CAG TCT AGA CCA GCA GCA ACC CGG CTC-3′；R 5′-CAG GGG CCC ACC TAT GGC TAC GAA GGC-3′。目标片段长度1069 bp，PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
图4 用25 mg·L-1 G418筛选抗性植株
Fig.4 Transgenic wheat plant selected by 25 mg·L-1 G418
图5 抗性植株移栽
Fig.5 Transgenic wheat plant culture in pot
1.6 用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法测定转基因植株中目的基因的拷贝数
用PCR检测为阳性的转基因植株为试验材料，小麦蜡质基因（wx012）作为内参基因。未转基因小麦基因组DNA为内参基因标准品进行5倍梯度稀释，得到内参基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线；以含pta 的质粒DNA 为目的基因标准品进行5 倍梯度稀释，建立目的基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线。通过SYBR GreenⅠREAL-TIME PCR 分别获得每一转基因植株中目的基因和内参基因的CT值，将CT值分别代入内参基因标准曲线、目的基因标准曲线，计算该材料中内参基因和目的基因的起始模板量，目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因植株中的拷贝数。
2 结果与分析
2.1 T0代植株PCR检测结果
以小麦抗性植株基因组DNA 为模板，以pta特异引物进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，9614-6、9614-10、9614-16、9614-17、陇春22-20、陇春22-22、陇春22-23 等7个植株都扩增出了与阳性对照相同的约1000 bp目标片段（图6箭头所示），其大小与预期片段大小相符，其他抗性植株中都没有扩增到目标片段，初步确定9614-6、9614-10、9614-16、9614-17、陇春22-20、陇春22-22、陇春22-23等7个植株为转基因植株。
图6 小麦抗性植株PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig.6 PCR analysis of transgenic wheat
6～10，12，14～18为9614转化的抗性植株，19～23为陇春22转化的抗性植株；“+”：质粒pBI pta阳性对照；“-”：阴性对照；水：模板对照；M：DNA Marker DL 2 000；图中箭头示约1000 bp的目标片段
2.2 转基因植株中目的基因的拷贝数
以CT值为X 轴，以起始模板拷贝数的对数为Y 轴，分别建立了内参基因和外源基因的标准曲线。由图7、图8可见，模板CT值与该模板起始浓度或拷贝数的对数存在线性关系，内参基因标准曲线为y=-0.2667x+6.98，r2= 0.998；外源基因的标准曲线为y=-0.2118x+4.53，r2=0.997。
从图9、图10 和表1 可以看出，所有的小麦植株中都扩增出了内参基因，而空白对照扩增曲线一直没有扬起，内参基因没有得到扩增，说明没有发生交叉污染，扩增结果可信。样本中内参基因的扩增都是特异性扩增，在熔解曲线中表现为单峰，熔点为87 ℃（见表1）。
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图7 wx012基因的标准曲线
Fig.7 Standard curve of wx012 between CT value and templates
图8 pta基因的标准曲线
Fig.8 Standard curve of pta between CT value and templates
图9 样本中wx012基因的扩增曲线
Fig.9 Fluorescence Data Graph of wx012 Gene
图10 样本中wx012基因熔解曲线
Fig.10 Melting Curve of wx012 Gene
图11 样本中pta基因扩增曲线
Fig.11 Fluorescence Data Graph of pta Gene
图12 样本中pta基因熔解曲线
Fig.12 Melting Curve of pta Gene
图13 T1代植株中外源基因的PCR检测
Fig.13 PCR analysis of T1 progeny transgenic wheat
1，2，3，4，5，6：T1代植株；7：阴性对照；8：阳性对照；9.DNA Marker DL 2000；箭头所指表示与阳性对照同等大小的目标条带
从图11、图12 和表1 可以看出，转基因植株除9614-17 以外其他都扩增出了目的基因。各转基因植株扩增曲线的CT值各不相同，介于28～33 之间，阴性对照及空白对照无扩增。pta基因的熔解曲线是单峰曲线，熔点为87.6 ℃。
根据表2 的计算结果，外源pta 基因在9614-6 有中3 个拷贝、9614-10 中有4 个拷贝、9614-16 中有4 个拷贝、陇春22-20 中有2 个拷贝、陇春22-22 中1 个拷贝、陇春22-23 中有3个拷贝。
表1 待测样本中内参基因、外源基因的CT值及Tm值
Table 1 Ct and Tm value of wx012 and pta genes in transgenic wheat
N/A表示无扩增。
表2 转基因植株中外源基因拷贝数的估算
Table 2 Estimation of copy number of pta gene in transgenic wheat
2.3 T1代植株中外源基因的PCR检测结果
对整合有2个拷贝pta基因的陇春22-20的T1代6个转基因株系进行PCR检测，结果如图13，有3个株系扩增出了与阳性对照同等大小的目标条带（见图13箭头所示）。证明pta基因在转基因小麦后代中得到了遗传。
3 讨论
适宜的培养基是成功转化的先决条件。笔者在小麦幼胚再生体系建立阶段尝试了W14、C17、B5、MS四种基本培养基与外源添加物组合的近10种愈伤组织诱导培养基、7种愈伤组织分化培养基发现：
①外源添加物如谷氨酰胺、水解酪蛋白、脯氨酸、天冬酰胺、乙磺酸等成分的添加与诱导的愈伤组织质量密切相关；
②在小麦愈伤组织诱导阶段可以不附加任何种类和水平的细胞分裂素，一般需在MS培养基中附加0.5～2 mg·L-1 2,4-D 及其他外源添加物，如谷氨酰胺、水解酪蛋白、脯氨酸、天冬酰胺等氨基酸类物质和AgNO3、Vc等防止愈伤组织褐化类的物质；
③从小麦愈伤组织诱导到分化阶段要逐渐降低2,4-D 浓度至零，小麦愈伤组织能否分化取决于愈伤组织本身状态，与分化培养基中是否添加细胞分裂素关系不大；
④愈伤组织在转接到分化培养基之前进行5～7 d的干燥处理，可显著提高分化率。
9614部分愈伤组织经干燥处理后分化率比常规培养的愈伤组织分化率提高约10%，陇春22愈伤组织干燥处理后分化率从原来的0提高到3.56% （文中未列出相关图表），这与Iann M.Rance等水稻成熟胚愈伤组织干燥处理可显著提高水稻再生频率的研究结论一致。
侵染前幼胚的生长状态和农杆菌菌株对小麦遗传转化效率的影响很大。本试验以诱导4 d的幼胚作为转化受体，获得的转化植株率均高于预培养0～3 d和6 d的幼胚。幼胚培养4 d 后愈伤组织逐渐形成，对农杆菌侵染有较强的耐受力，而且在侵染后可以立即进入细胞旺盛分裂，有利于外源基因的整合。同时，研究发现不同的农杆菌菌株对小麦幼胚愈伤组织的侵染能力不同。本课题组在小麦转基因研究试验中先后采用了LBA4404、EHA105、C58c1 三个菌株进行9614、陇春22 的遗传转化，LBA4404 和EHA105 两个菌株均未得到转化株，C58c1 侵染得到6 株转化植株。说明在农杆菌介导的小麦遗传转化中C58c1 较LBA4404和EHA105的转化效果好。
Southern 杂交是经典的检测转基因植株中外源基因拷贝数的方法，实时荧光定量PCR技术是一种新的DNA定量方法。研究发现，利用Southern杂交和荧光实时定量PCR这两种方法检测转基因拷贝数结果十分接近，但也发现有小部分结果不一致，主要表现为用荧光实时定量PCR 法检测的转基因外源拷贝数常多于Southern 杂交法的检测结果。理论上来说，荧光实时定量PCR 所检测出的拷贝数可能更接近于客观事实。本研究选用SYBR Green I 荧光染料，采用相对标准曲线法计算出了转基因植株中外源pta 基因的拷贝数分别为单拷贝的有1株，2个拷贝的有1株，3个拷贝和4个拷贝的各有2株。
外源基因以不同拷贝数整合进小麦基因组后，其能否在后代稳定遗传是值得关注的，本研究得到的整合有2 个拷贝pta 基因的陇春22-20 的T1代，6 个转基因株系中有3 个株系外源基因得到了遗传，外源基因在T2、T3及更多后代群体中的遗传规律还需进一步追踪研究。
参考文献（略）
李淑洁，张正英：甘肃省农业科学院生物技术研究所