SSR标记甘肃栽培党参种质资源的遗传多样性分析[5]
党参（Codonopsis pilosula）是桔梗科党参属的栽培植物，是我国一种十分常用的中药，也是多年生缠绕草本植物。党参作为我国传统的大宗中药材，以根入药，分布广泛，品种多样，具有良好的药用价值。甘肃具有得天独厚的生态环境和气候条件，拥有非常丰富的药用植物资源，是党参和当归等名贵药用植物的道地产地和主产区。
目前，SSR 分子标记技术已在粮食经济作物等标记研究中广泛得以应用，中草药上应用得相对较少。有关党参在DNA分子遗传多样性方面的研究多以RAPD标记居多。李忠虎利用磁珠富集法分离党参基因组微卫星DNA，从而设计出SSR引物对样本材料进行遗传多样性分析；王东通过软件分析党参转录组文库EST序列的SSR 位点进行引物设计，最终筛选出15对可使用的微卫星引物。
为了解甘肃党参的遗传背景，为其规范化栽培和育种提供分子生物学依据，本研究利用已公布的党参多态性微卫星引物及本实验室自行设计筛选出的数对SSR引物，对采自甘肃六大主栽区的58 份党参种质材料进行遗传多样性研究，探明甘肃党参资源的遗传背景和结构组成，以期为党参种质资源的评价和优异基因挖掘奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试党参材料随机采集于甘肃省党参种植的6 大主栽区，共58 份材料，见表1。采集材料的新嫩叶片用硅胶干燥后带回，实验室进行基因组提取备用。
表1 供试品种的编码及产地来源
Table 1 The coding and origin of test meterials
续表1
续表1
1.2 引物的设计与合成
本试验从已有的2 篇文章中查找到25 条SSR 引物，并从NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下载了部分含有微卫星的党参Nucleotide 序列及近缘属羊乳的EST 序列。应用SSR Hunter 和Primer Primer 5.0 软件搜索微卫星并设计引物80 对，以12 份遗传背景差异大的党参为模板共筛选出16对可利用的引物。
1.3 DNA提取
采用天根的植物提取基因组试剂盒进行样品DNA 的提取，提取完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳进行样品质量的检测，并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，将DNA 稀释至20～50 ng/uL，4 ℃保存备用。
1.4 PCR扩增和产物检测
PCR 扩增体系总反应体积20 μL，包括2×Taq Master Mix 10 μL，DNase-Free Water 7 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，党参基因组1 μL。反应程序：95 ℃热启动3 min，95 ℃变性45 s，48～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 个循环后，72 ℃终延伸5 min。用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，银染色法进行检测。
1.5 数据统计与分析
采用人工读带的方法，将电泳图上可重复的、易分辨的条带记为“1”，同一位置无带计为“0”，建立原始数据矩阵。利用PopGen32 软件计算群体的观测等位基因数（allele number，Na）、有效等位基因数（effective number of allele，Ne）、Shannon信息指数（Shannon’s information index，I）、遗传一致度（genetic identity）和遗传距离（genetic distance），计算多态性信息含量（polymorphism information content，PIC），PIC=1-∑ijp2 ij，式中，p表示位点i的第j个等位变异出现的频率。以NTSYS-pc软件计算遗传相似系数（Genetic Similarity，GS），按照非加权配对法UPGMA 和SHAN 程序进行聚类分析，按Eigen 程序进行主成分分析。
2 结果
2.1 引物的多态性分析
筛选出的16对引物（见表2）共扩增出125个条带，扩增片段长度为100～450 bp，每对引物扩增条带数为3～14 个，平均为7.8 个，多态性条带为120 个，多态位点百分率（PPB）为96%。多态信息含量（PIC）变幅为0.1979～0.4367，平均为0.3378。PIC＜0.25，是低度多态位点，共有1个SSR标记DS12，其PIC值最低；PIC＞0.50是高度多态位点，没有符合的标记；其余15个为中度多态位点（0.25＜PIC＜0.50），其中DS04位点的PIC 值最高，DS05次之，图1为引物DS10在58份种质材料上的扩增结果。
表2 党参SSR引物序列
Table 2 The SSR primers for Codonopsis pilosula
续表2
(https://www.daowen.com)
图1 引物DS10对58份党参材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Fig.1 The polyacrylamide gel electrophoresis with primer DS10 of 58 materials for Codonopsis pilosula
2.2 6个党参居群的遗传多样性与遗传变异分析
供试的6 个甘肃栽培党参居群平均等位基因数（Na）1.9524，平均有效等位基因数（Ne）1.5078，平均Nei’s 基因多样性（H）为0.3061，平均Shannon’s 信息指数（I）为0.4658，多态位点百分率（PPB）为96%。从表3 中看出，甘肃党参栽培居群整体遗传多样性高，资源丰富，其中渭源的Ne、H、I 值和多态位点百分率在6 个居群中都具有最大值，表明该地区的党参资源遗传多样性最高，种质资源最为丰富，漳县、宕昌、会川次之，岷县相对较低，表明岷县的栽培党参资源遗传多样性较低。
根据POPGEN 的分析结果，6 个党参居群的总遗传多样度（Ht）为0.3118，居群内遗传多样度（Hs）为0.2655。居群间遗传分化系数（Gst）为0.1484，表明14.84%的遗传变异存在居群间，85.16%的遗传变异存在于居群内部，基因流（Nm）为2.8685，表明党参居群间差异很小，但居群内个体的差异较大，居群间有明显的基因交流。
表3 甘肃6个党参居群的遗传多样性参数
Table 3 The genetic diversity for 6 population of Codonopsis pilosula in Gansu
2.3 6个党参居群的遗传距离及居群聚类分析
从表4 看出，6 个党参居群的遗传相似度为0.8699～0.9645，遗传距离为0.0361～0.1394，其中漳县和陇西的遗传距离最小（0.0361），遗传相似度最大（0.9645）；宕昌和会川的遗传距离最大（0.1394），遗传相似系数最小（0.8699）。利用UPGMA，根据遗传相似系数构建居群间的聚类图（图2），6 个居群大致呈从属关系，在虚线位置1 处可分为两个类群，宕昌单独成群，为I 类，第II 类包含漳县、岷县、陇西、渭源和会川5 个居群。第II 类群在虚线位置2 处可分为3 个亚群，漳县和陇西、岷县和渭源两两成群，会川单独为一个亚群。供试的栽培党参居群间遗传基础较窄，遗传距离与其来源产地的地理位置分布有一定的相关性。
表4 甘肃6个党参居群间的遗传相似度（GI）和遗传距离（GD）
Table 4 The genetic identity（GI）and genetic distance（GD）between 6 populations of Codonopsis pilosula in Gansu
注：上三角是遗传一致度，下三角是遗传距离。
Note：Nei’s genetic identity （above diagonal）and genetic distance （below diagonal）.
图2 6个党参居群的聚类图
Fig.2 The cluster analysis dendrogram of 6 population in Codonopsis pilosula
2.4 58份党参种质的聚类图
利用UPGMA，根据遗传相似系数构建58个党参种质资源遗传关系聚类图（图3）。结果表明，在阈值0.7 时可将58 份材料分为2 个大类，其中第I 类包含55 份党参材料，第II类包含材料3、13、58，分别来自宕昌、漳县和会川。聚类分析结果表明，种质资源与其地理分布并不存在明显的相关性，6 个主栽区种植的党参互相交错，这与薛德对五节芒的研究结果一致。
图3 58份党参材料的聚类图
Fig 3 The cluster analysis dendrogram of 58 materials in Codonopsis pilosula
2.5 58份党参种质的主成分分析
利用NTSYS 软件对遗传相似系数矩阵进行主成分分析，如图4，第1 主成分和第2 主成分解释变异的贡献率分别为7.08%和6.62%，累计贡献率为13.70%。将位置靠近的党参材料归为一类，可将供试材料归为两大类，与聚类结果一致，表明供试栽培党参种质间遗传相似度高，遗传基础较窄。
图4 58份党参材料的主成分分析
Fig 4 The principal coordinate analysis（PCOA）for 58 materials of Codonopsis pilosula
3 结论
3.1 党参SSR引物开发统计表明，遗传距离相近的物种更可能共用SSR引物。吴根松在梅花的SSR 引物开发上就使用了其近缘物种的SSR 引物并取得显著成效。本研究结果也验证了从党参近缘属羊乳中开发出的引物在党参材料间检测出多态性，可作为党参的微卫星引物使用。此外，从PIC结果看出，16对引物中有15对具有中度多态标记，仅有1对引物为低度多态标记，表明筛选出来的引物能够很好地进行党参遗传多样性的检测。
3.2 甘肃栽培党参具有丰富的遗传多样性，主要的遗传变异存在于居群内，居群间有明显的基因交流。试验结果表明，甘肃栽培党参在物种水平上具有丰富的遗传多样性，这与前人用AFLP、RAPD 及ISSR 的研究结果一致。从DNA 水平上验证了党参种质间丰富的遗传变异能力，表明党参具有较强的环境适应能力。此外，从居群聚类图上可以看出，漳县和陇西、岷县和渭源的党参优先聚为一类，这与产地来源存在一定关系。
3.3 甘肃栽培党参在遗传组成上具有较高的同源性，遗传基础较窄。从聚类图和主成分分析结果来看，供试58 份甘肃栽培党参种质可划分为2 大类，6 个来源产地的材料相互交错，杨宁利用RAPD 分子标记结果表明，甘肃党参资源间的变异范围较小，种间遗传关系较近，与本研究结果一致。据市场调研显示，能自育党参种苗的地区较少，多数材料均来源于同一公司或优势种植地，因此遗传基础相对狭窄。从遗传距离上看，甘肃栽培党参居群间有一定的地域关系，但是种质材料间的遗传距离和产地来源并不相关，有学者的研究结果也表明多样性与地域性没有明显关系。
4 讨论
党参药用历史悠久，品种来源甚多，由于产地、来源和加工方法不同，药材质量有很大差别，商品名称也十分混乱。甘肃是党参的主要产区，产量居全国之首。介于SSR引物开发的难度，加快党参等中草药的引物设计和开发，有助于深入开展SSR在药用作物研究中的应用。党参没有全基因组序列，因此选择的SSR标记不能覆盖党参全基因组，所以获得的试验结果仅反映供试材料在基因组部分区域的遗传多样性。研究结果表明，供试6个甘肃栽培党参居群遗传多样性丰富，总体上遗传背景相似度高，遗传基础狭窄，育种工作有待进一步加强野生种质资源的利用，创新党参育种材料。本研究结果可为保护党参的多样性和开发利用提供技术支持和理论根据。
参考文献（略）
刘新星，陈玉梁，石有太，罗俊杰，厚毅清，张艳萍：甘肃省农业科学院生物技术所