外源基因表达的原位杂交检测

原位杂交是通过杂交确定被检物在样本中的原本位置，是目前外源基因在染色体上定位及外源基因在组织细胞内表达定位的主要方法。

1.组织细胞mRNA原位杂交

该技术是将核酸杂交技术与组织细胞学实验技术相结合，对特异的mRNA序列进行组织细胞分布的空间定位。导入外源基因可以引起转基因产生各种类型的突变，而通过mRNA 原位杂交可获得外源基因是否表达以及转基因植物组织细胞内表达部位的信息，为基因功能定位提供依据。同时，通过mRNA 原位杂交能够确定外源mRNA 细胞甚至亚细胞水平的基因表达的时空特征，所以mRNA 原位杂交也是研究基因表达调控的主要方法之一。

组织细胞mRNA原位杂交原理：通过化学固定使植物组织细胞保持天然形态结构。在固定过程中mRNA及其他大分子化合物被原位固定在组织细胞内。将组织制成薄切片封固在载玻片上，经蛋白酶消化去除蛋白质。反义RNA 或cDNA 探针渗入组织细胞，与靶mRNA 杂交。根据探针标记物的物理化学及免疫性质检出杂交体。从杂交体的解剖位置可得知特异mRNA在组织细胞中的分布，从而确定基因的表达部位。(https://www.daowen.com)

2.外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位

外源基因表达蛋白的免疫定位是指利用外源基因表达蛋白的抗体通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布。对于真核细胞来说，蛋白质位于不同的亚细胞部位，其所行使的功能也不同，或者说蛋白质表达部位发生错误就会失去预期的功能，从而对细胞乃至对整个机体产生影响。在植物基因工程领域，通过优化碱基序列、使用组成型启动子、加载增强子等方法提高外源基因的表达水平，蛋白质植物细胞内的定位活动也能够影响重组蛋白的稳定性、生物活性和积累质量。而表达蛋白定位是研究基因功能的重要方法，尤其是在不知道其编码蛋白结构及功能情况下克隆的基因。通过表达蛋白的组织细胞定位不仅可明确转基因植物中外源基因的功能及外源蛋白的稳定性，还能回答表达蛋白在功能部位的表达量、是稳定表达还是诱导性表达，能否稳定积累等问题。因此，表达蛋白的组织细胞定位是植物基因工程中必然涉及的问题。此项技术为基因功能分析所必需的。

蛋白质免疫定位属组织化学技术，是利用蛋白质特异的抗体检测目标蛋白质在细胞中的位置的方法。一般是将抗体进行标记后识别植物细胞切片中的目标蛋白质，然后借助光学显微镜或电子显微镜观察其所在位置，根据抗原抗体的结合部位确定目标蛋白的位置。但是要明确外源基因表达蛋白在转基因植物组织细胞中的空间定位，需要制备的组织切片能良好保持组织细胞形态结构。免疫定位检测效果与转基因植物组织中外源蛋白质的表达量相关。

蛋白质组织细胞定位试验程序包括植物组织固定和包埋、包埋组织块切片和封固、免疫反应及检出。该技术成功的关键在于切片的质量、固定以及具备目标蛋白质的特异性的抗体，将免疫细胞化学方法与电镜技术联用最大的优点就是体内定位系统，反映的是活体状态下外源蛋白质在细胞中的位置，是最直接、准确的定位方法。