甘肃黄芪资源的遗传多样性和聚类分析[6]
黄芪（Astragalus membranaceus），为豆科多年生草本植物，是常用的中草药之一。其根部入药，具有益气固表、利水消肿、脱毒、生肌的功效，在中药中占有重要地位。据统计，以黄芪为原料的中成药多达200 余种。由于黄芪入药的根部需生长三年，较为珍贵，而野生黄芪数量急剧减少，因此，现药用黄芪的来源多为人工栽培。甘肃是药用黄芪的主产区之一，近年来，除渭源县、陇西县种植黄芪外，宕昌县、漳县、武都区等地也开始规模种植，由于黄芪种类繁多，而正品黄芪仅为膜荚黄芪和蒙古黄芪两种，因此，甘肃黄芪资源遗传现状的调查显的尤为重要。
SSR 分子标记技术是物种遗传分析和品种鉴定的一项流行技术。与传统的遗传分析方法相比，该技术可在分子层面对物种的遗传特征进行阐释，省去了大量的形态、细胞特征等表型的统计工作，减少标记的“人为”特征，可提高能效与准确度。该方法已在不同物种遗传研究中广泛应用，如宋艳梅利用SSR分子标记技术分析了山东同一种植基地不同形态栝楼的遗传多样性和亲缘关系，绘制了7个栝楼样品的指纹图谱。肖承鸿对80份太子参种质资源进行表型遗传多样性分析，最终将参试的种质资源聚类为四个类群。李猛在天然蚬壳花椒种群遗传多样性的ISSR 标记分析中将中国西南4 省共12 个天然蚬壳花椒种群进行遗传多样性分析，得出天然蚬壳花椒在物种和种群水平上均具有较高的遗传多样性，天然蚬壳花椒种群间存在着高度的遗传分化的结论，为蚬壳花椒的遗传多样性分析奠定了理论基础。总之，SSR 分子标记是一项成熟、可靠的遗传分析技术。
本文利用近缘物种SSR 引物的通用性，在筛选验证9 对SSR 引物有效的基础上，对甘肃6处主产区的57份黄芪资源进行资源调查及遗传多样性分析，为甘肃黄芪资源的筛选利用提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
参试黄芪样本随机采集于甘肃省境内黄芪主要栽培地区，共57 份材料（见表1），各样本采集单株新嫩叶片进行基因组提取。
表1 甘肃黄芪57份种质资源的地理位置
Table 1 The geographical location of Astragalus membranaceus 57 germplasm resources in gansu province
续表1
续表1
注：编号字母中，“H”代表红芪，“D”代表东俄洛黄芪，“G”代表蒙古黄芪，“J”代表膜荚黄芪。黄芪种质鉴定用基原鉴定法。
Note: The number of letters，"H" on behalf of Astragalus membranaceus （Fisch.）Bunge.，"D" on behalf of Astragalus tongolensis，"G" on behalf of Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var.mongholicus （Bge.）Hsiao，"J"on behalf of Astragalus membranaceus （Fisch.）.
1.2 方法
1.2.1 总基因组的提取与检测
采用TIANGEN 植物基因组DNA 提取试剂盒提取基因组，通过紫外分光光度计检测纯度及浓度，定量基因组为10 ng/μL，将基因组保存于-25 ℃冰箱中备用。
1.2.2 引物筛选
收集已公开亲缘相近作物的引物101 对，经过综合评估其多态性、重复性及稳定性，最终筛选出9 对引物用于本次试验，引物序列如表2。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Tap DNA Master Mix为Takara品牌，购自宝生物工程（大连）公司。
表2 黄芪SSR 引物序列
Table 2 Primers for SSR of Astragalus membranaceus
续表2
1.2.3 扩增及产物的检测
采用Bio-Rad T100 梯度PCR 仪对黄芪基因组进行扩增。扩增程序：95 ℃变性5 min，95 ℃变性1min，47～60 ℃（温度随引物不同而定）退火40 s，72 ℃延伸45 s，共30 个循环，72 ℃后延伸5 min，4 ℃冰箱保存；反应体系：25 μL 体系中2×Taq Master Mix 12.5 μL，100 μmol/L 的上下游引物各1 μL，基因组1 μL，去离子水9.5 μL。
扩增产物用含6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，210 V 电泳1.5 h 左右，用Bio-Gel D6C XR+凝胶成像系统和尼康相机分别观察、拍照及保存。
1.3 数据统计与分析
整理电泳照片，人工选取分子量范围为100～500 bp、清晰可辨的扩增条带进行统计分析，对于同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带为1个位点，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，依次构建数据矩阵。根据表征矩阵统计SSR扩增产物的条带总数和多态性条带总数，计算引物多态性信息含量（PIC），PICi=2fi（1-fi），式中，PICi表示引物的多态性信息含量，fi表示有带所占的频率，1-fi表示无带所占的频率。采用PopGen32 软件计算居群间等位变异数（Na）、有效等位基因数（Ne）、基因多样性（H）、香农信息指数（I）、多态位点比率（P）；居群内遗传多样度（Hs）；居群间遗传分化系数（Gst）；基因流（Nm）。利用NTSYSpc2.10e 软件计算参试样品的遗传距离（GD）和遗传相似系数（Gs），用非加权配对算术平均法（UPGMA）构建亲缘关系聚类树状图。
2 结果与分析
2.1 SSR扩增多态性分析
利用9 对有效引物对57 个样本的DNA 进行PCR 扩增，PCR 产物的分子量为100～1200 bp，形成了带型丰富的电泳图谱（图1），其重复性好，清晰度高，通过统计有效引物共扩增出82 个位点，多态性位点百分比为95.56%（表3），平均每条引物的多态信息值为0.438。多态信息含量是衡量微卫星位点多态性高低的较好的指标，一般来说，当PIC＞0.5 时，具有高度多态性；当0.25＜PIC＜0.5 时，具有中度多态性；当PIC＜0.25 时，具有低度多态性，试验结果表明，参试SSR引物可以使黄芪产生较为丰富的多态性条带。
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图1 引物ZYS3对57个样本的扩增结果
Fig.1 SSR amplification results of primers ZYS3
表3 黄芪的遗传多样性及遗传分化系数
Table 3 Genetic diversity analysis and Genetic differentiations among of Astragalus membranaceus
2.2 黄芪的遗传变异与遗传分化
表3 结果显示，黄芪在物种水平上Nei’s 指数为0.279，Shannon 信息指数为0.431，各居群内Shannon 指数范围为0.277～0.439，Nei’s 指数范围为0.182～0.294。该结果表明，无论物种水平层面，还是在各居群内部，参试黄芪样本都表现出较高水平的遗传多样性。
黄芪居群的遗传分化情况见表3，57 份样本总的遗传多样度Ht 为0.280，居群间遗传分化系数Gst 为0.117，即11.7%的遗传变异存在于居群间，88.3%的遗传变异存在于居群内部。居群内遗传多样度Hs 为0.248，平均基因流Nm 为3.7746。该结果表明，黄芪居群间差异很小，但居群内个体的差异较大，居群间有明显基因交流。
2.3 不同居群的遗传距离与聚类分析
黄芪不同居群间遗传一致度和遗传距离的计算结果见表4。陇西县和渭源县黄芪间的遗传距离最小（0.023），遗传一致度最大（0.977），漳县和武都区黄芪间的遗传距离最大（0.110），遗传一致度最小（0.896）。根据居群间的遗传距离，采用UPGMA 法对6 个居群进行聚类绘图（图2），类群间大致呈现从属关系，居群亲缘关系的远近与地理距离远近大致相关。
表4 黄芪不同居群间的遗传一致度和遗传距离
Table 4 Genetic identity and distance between different populations of Astragalus membranaceus
注:上三角是遗传一致度，下三角是遗传距离。
Note:Nei’s genetic identity （above diagonal）and genetic distance （below diagonal）.
图2 黄芪6个居群的UPGMA遗传聚类图
Fig.2 UPGMA dendrogram of 6 populations for Astragalus membranaceus
2.4 57份样本的聚类分析结果
图3 聚类分析结果显示，在相似度为0.46处57份样本分为两类，H57（岩黄芪属）为一类，剩余56 份样本（黄芪属）为另外一类；在相似度为0.67 处，56 份黄芪属样本分为两类，J30、J48、G25、G39、J7 为一类，剩余51 份样本为一类；在相似度为0.68 处，剩余51份样本可划分为两类，一类包括17个样本，其中膜荚黄芪占64.71%，另一类有34个样本，其中蒙古黄芪占76.47%。该结果说明，参试引物形成的聚类分析结果可以区分岩黄芪属和黄芪属，但是不能区分黄芪属中的膜荚黄芪、蒙古黄芪及东俄洛黄芪。
图3 57份黄芪资源基于SSR遗传相似性的UPGMA聚类图
Fig.3 57 Astragalus membranaceus based on SSR genetic similarity of UPGMA clustering
3 讨论
3.1 近缘植物所用SSR引物在黄芪遗传分析上的表现
利用SSR 引物的通用性分析近缘科属植物的遗传多样性是一项成熟的分子标记方法，该方法主要针对基因序列报道较少，难以开发出SSR引物的小物种。由于黄芪已知的基因序列公布极少，美国国立生物技术信息中心（NCBI）报道的基因序列仅为401条，不足以开发适宜的SSR 引物，因此，本次试验所用引物为近缘科属植物成功应用的SSR 引物，通过规范筛选101 对SSR 引物后，9 个有效引物形成的聚类分析结果可以在相似度为0.46 处明显区分参试样品中的岩黄芪属与黄芪属，黄芪属中参试样品的相似度区间为0.67～0.87。通过对比以往文献，李水福在早期研究过程中通过植物形态显微结构，赋值量化数据进行聚类分析，黄芪属与岩黄芪属可在相似度为0.50 左右区分为两类。吴海燕通过ISSR 分子标记技术比较了黄芪属与岩黄芪属的DNA 指纹图谱，通过聚类分析，在相似度为0.49 处明显区分黄芪属和岩黄芪属，并确定20份黄芪属样品的相似度区间为0.51～0.87。笔者的试验结果与以往研究成果非常接近，因此，本次试验中参试SSR引物对黄芪的遗传多样性分析结果较为可靠。此外，本次试验的聚类分析结果不能准确区分黄芪属中的膜荚黄芪、蒙古黄芪和东俄洛黄芪，岩黄芪属的红芪、黄芪属的东俄洛黄芪在中药药理上与正品黄芪不同，严格划分应属于伪品，因此，黄芪的基因序列还需要进一步的发现和补充，以便开发更精准的分子标记。
3.2 甘肃黄芪遗传多样性特征分析
笔者通过试验发现，甘肃主栽地区的黄芪遗传多样性具有居群内部遗传多样性高、居群间遗传变异率低、基因流动大的特点。吴松权在研究膜荚黄芪传粉特征时发现，异株异花授粉、自由授粉、同株异花授粉和套袋自花授粉4 种授粉方式的结实率差异明显，其平均结实率分别为81%、56%、1%和0。冯学金在研究蒙古黄芪的传粉特性中也发现自由授粉、套袋自花授粉的亲和指数分别为1.26和0，因此，黄芪为自交不亲和的异花授粉植物，此外，此次随机采集样品中蒙古黄芪、膜荚黄芪所占比例最高分别为59.65%和36.84%，剩余红芪及东俄洛黄芪占3.51%，因此推测自交不亲和的异花授粉方式及居群内蒙古黄芪与膜荚黄芪的混杂是黄芪居群内部遗传多样性较高的主要原因。由于参试黄芪资源所处地理环境差异小，人工栽培又使黄芪的自然选择压力较小，因此，黄芪居群间遗传分化系数较低。但是，居群间有很高的基因交流系数，基因流系数达到3.775，该结果也在以往研究中频频出现，王敖在蒙古黄芪和膜荚黄芪居群遗传多样性研究中发现，栽培的蒙古黄芪群体间的基因流系数为3.549，而野生膜荚黄芪居群间基因流系数为0.855，并推测栽培黄芪居群之间具有较高基因流的原因是长期以来人为的从不同居群进行引种，从而造成了居群遗传信息的混合，王雪凤在内蒙古地区栽培及野生蒙古黄芪的ISSR 遗传多样性研究中也发现蒙古黄芪经过栽培后，其遗传分化降低，基因流增加。笔者认为由于近年来甘肃中药市场逐渐规范化，而市场形成中药种子的流通是居群间基因交流的主要通道。该结果可进一步说明，与自然环境选择相比，受人为干预的生态环境可以导致物种内部基因交流水平发生较大变化。
4 结论
甘肃黄芪资源较为纯正，其丰富的遗传多样性及小居群间稳定的基因流动态可维持甘肃黄芪的种质特征，此外，渭源县和陇西县的种质资源相对道地，可作为黄芪品种筛选及开发所需的种质资源。
参考文献（略）
厚毅清，张艳萍，石有太，刘新星，陈玉梁：甘肃省农业科学院生物技术研究所
【注释】
[1]本论文在《植物保护》2012年第38卷第3期已发表。
[2]本论文在《中国中药杂志》2016年第41卷第10期已发表。
[3]本论文在《种子》2011年第30卷第12期已发表。
[4]本论文在《农业现代化研究》2015年第36卷第3期已发表。
[5]本论文在《中药材》2016年第39卷第8期已发表。
[6]本论文在《中药材》2016年第39卷第6期已发表。