甘肃主栽小麦品种及骨干亲本花药培养特性评价及分析[1]
单倍体育种因具有杂种后代纯合快、育种周期短、选择效率高等优点，受到育种者的广泛重视。其中花药培养是产生小麦单倍体最主要的途径之一。因此，对重要种质资源的花药培养特性进行评价，并筛选出具有较高花药培养力的基因型是小麦花培育种中重要的基础性工作。近年来国内外相关研究者已筛选出石4185、新春9号等优良花培亲本。
小麦（Triticum aestivum）是甘肃最主要的粮食作物之一，常年种植面积在100 万hm2以上。长期以来，常规杂交育种技术作为甘肃多家育种单位采用的主要育种方法，已育成了一大批小麦新品种，在生产中发挥了重要作用；近年来，随着品种更新换代速度加快，花培育种技术的优势凸显，然而，由于对甘肃重要小麦材料的花药培养特性至今仍不明确，致使该地区花培育种进展缓慢。
本研究对甘肃近年来审定和主栽的小麦品种及部分骨干亲本进行花药培养，以获得愈伤组织诱导率、分化率等数据，分析这些材料的花药培养特性，鉴定并筛选出具有较高花药培养力的材料并对其应用潜力进行分析，以期为小麦花培育种及相关研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为甘肃省主栽品种及骨干亲本，共86份，其中春小麦品种18份，品系7份，冬小麦品种37 份，品系24 份，由甘肃省农业科学院小麦研究所及生物技术研究所、定西市农业科学院、天水市农业科学研究所等提供。种植于甘肃省农业科学院兰州市试验地，行长1.2 m，行距0.2 m，手锄开沟撒播，每份材料种植5 行，冬小麦于2013 年10 月9 日种植，每行108粒，春小麦于2014年3月16日种植，每行126粒，常规田间管理。
1.2 方法
挑选每个基因型中大小一致、经镜检其大部分花药中小孢子发育至单核后期的小麦幼穗，置4 ℃冰箱内低温处理2～3 d，接种前在超净工作台上用75%的乙醇喷雾进行表面消毒，无菌水冲洗3 次，取出处于麦穗中部2/3 处的小穗，将其中的花药接种于诱导培养基上。接种后32 ℃高温处理7～10 d，之后转入24 ℃暗培养，待愈伤组织块状直径为2～3 mm 时转至分化培养基中，置于24 ℃、光16 h/暗8 h 进行分化培养。诱导花药愈伤组织培养基为W14+2,4-D （2.0 mg·L-1）+KT （0.5 mg·L-1）+AGP （400 mg·L-1）+蔗糖（9%），分化培养基为MS+KT （2.0 mg·L-1）+IAA （0.15 mg·L-1）+蔗糖（3%）。每份材料接种3瓶，每瓶接种50枚花药，重复3次。按以下公式计算相关指标：
愈伤组织诱导率=产生的愈伤组织块数/接种花药数×100%
绿苗分化率=分化绿苗数/转分化愈伤数×100%
绿苗生产率=分化绿苗数/接种花药数×100%
白苗分化率=分化白苗数/愈伤组织块数×100%
1.3 统计分析
利用Excel和SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。方差齐性检验用Duncan法检测，非齐性检验用Tamhane’s T2法检测。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织诱导及绿苗分化情况分析
愈伤组织诱导率是反映花药培养特性的最重要的指标之一。在供试的86 份材料中，35 份无愈伤组织产生，均为冬小麦材料，占供试材料总数的40.70%，分别为兰天10 号、兰天14号、兰天15号、兰天17号、兰天18号、兰天19号、兰天20号、兰天24号、兰天25 号、兰天27 号、兰天30 号、天选45 号、天选50 号、清农1 号、陇鉴386、平凉44 号、平原50 号、PASCAL、长武131、川麦107、航选01、兰092、天S98351、天01-29、天01-104-3-1、天02-204-1、CP20-30-1、CP04-46-2-1-2、00155-5-1-1-2-2-1-1-1、05-140、甘冬017、陇原034、条601、863-13、96-313。其余可诱导出愈伤组织的51 份材料中，春小麦为25份，冬小麦为26份。
由表1 可知，在25 份春小麦材料中（序号1～25），愈伤组织诱导率为0.67%～88.67%，平均为18.26%，愈伤组织诱导率超过12%的材料有10份，其中9016的诱导率最高（88.67%），其次是9629-16，为81.33%；陇春21 号、陇春27 号、陇春31 号、陇春32号、宁春4号、定丰12号、4-8和9614的花药也较易诱导愈伤组织；而陇春26号、西旱2号、定丰9号、定丰16号、定丰17号和89122等材料的花药愈伤组织诱导相对较难。在26份冬小麦材料中（序号26～51），愈伤组织诱导率为0.67%～31.33%，平均为9.03%。有7份材料的愈伤组织诱导率超过12%，以兰天094 的诱导率最高，兰天21 号、环冬6 号、兰天094、04-13-10、04-550-2-2-1、04-341和PL44也是较易诱导愈伤组织的材料；兰天2号、天选39号、陇鉴103、P474等则属于较难进行诱导花药愈伤组织的材料。(https://www.daowen.com)
绿苗分化率是反映花药培养特性的又一重要指标，愈伤组织能否分化成绿苗或绿苗分化率的高低是决定花药培养成效的关键因素。在有愈伤组织产生的51 份材料中，经对其愈伤组织转接进行分化培养，结果表明，在25 份春小麦材料中，绿苗分化率为0～143.74%，平均为33.34%，其中9 份未能分化出绿苗；14 份材料的绿苗分化率超过21%，以定丰12 号的分化率最高，达到143.74%；而2013s2 较难分化出绿苗。在26 份冬小麦材料中，绿苗分化率为0～100.00%，平均为11.12%，其中17 份未能分化出绿苗；绿苗分化率超过21%的有5 份材料，从高到低依次为陇鉴103、兰天31 号、中梁26 号、陇鉴196 和陇鉴108 （表1）。
在本试验体系条件下，花药培养时春小麦较冬小麦材料更易于诱导愈伤组织并分化出绿苗。25 份春小麦材料均有愈伤组织产生，超过一半的冬小麦材料则对花药培养无反应；而春小麦材料的平均绿苗分化率是冬小麦的3倍。同时，未能产生绿苗的大部分材料的愈伤组织诱导率较低，而部分材料尽管其愈伤组织诱导率并不低，但也未能分化出绿苗，如兰天094；反之，绿苗分化率高的材料其愈伤组织诱导率也不一定高，如5509-3。相关分析结果表明，愈伤组织诱导率和绿苗分化率并不具有相关性（r=0.287，P=0.379）。
表1 不同基因型小麦的花药愈伤组织诱导率及绿苗分化率
Table 1 Callus induction and green plantlet differentiation frequency in the wheat anther culture of different genotypes/%
表2 不同基因型材料的绿苗生产率
Table 2 Green plantlet production frequency in the wheat anther culture of different wheat genotypes/%
表3 不同基因型材料的白苗分化率
Table 3 Albino plantlet differentiation frequency in the wheat anther culture of different wheat genotypes
2.2 不同基因型材料的绿苗生产率分析
绿苗生产率，又称绿苗产率或绿苗生产力，由于直接将绿苗数和接种花药数结合而略去了中间的愈伤组织诱导情况，更能较大程度地反映花药培养成效，因此是花药培养力的重要指标。
本研究选取可分化出绿苗的25 份材料计算绿苗生产率，结果表明，不同基因型材料的绿苗生产率为0.67%～56.67%，平均为9.92%。绿苗生产率在8%以上的材料有9份，均为春小麦品种（系），其中品种5份，分别为陇春21号、陇春27号、陇春31号、宁春4号和定丰12号，品系4份，分别为4-8、9614、9016和9629-16。陇春31号和9016的绿苗生产率最高，均达到50%以上（表2）。参考赵林妹等将同时在愈伤组织诱导率、绿苗分化率和绿苗生产率上分别达到12%、21%及8%以上作为具有高培养力的标准，结合表1 和表2 对9 份材料分析可知，除4-8 外有8 份材料均达到这一标准，4-8 的愈伤组织诱导率、分化率和绿苗生产率分别53.33%、19.11%和10.00%，而在表1 中其分化率与定丰10 号的分化率26.47%之间无显著差异，因此可认为4-8亦达到这一标准。由此证明了绿苗生产率作为花药培养力重要指标的有效性和可行性。
2.3 白化苗分化情况分析
在51 份产生愈伤组织的材料中，有14 份材料的愈伤组织可分化出白苗，占27.45%，除陇鉴108 外，其余均为春小麦材料。白苗分化率达到20%以上的材料有4 份，其中最高的为定丰10 号，达到60.92%；其次为5509-3、定丰12 和陇春27 号；而宁春4 号、9614、9016等材料最低。就绿苗与白苗之比而言，定丰10号产生的白苗数量是绿苗的2倍多，为0.44，其次为2013s2，为1.00，说明其白苗产生的数量和绿苗的数量相同（表3）。综合表1、表3 可知愈伤组织诱导率和绿苗分化率高的材料也易分化出白苗，但同时发现，在同一基因型中，愈伤组织诱导率和白苗分化率之间并不具有直接相关性。
3 结论
绿苗生产率是评价小麦花药培养力的重要指标，本研究从86 份甘肃主栽小麦品种（系）和骨干亲本中筛选出9 份具有较高花药培养力的材料，为利用甘肃小麦种质资源进行花培育种提供了重要的参考依据。
参考文献（略）
王炜，陈琛，叶春雷，王方，罗俊杰：甘肃省农业科学院生物技术研究所
贺小宝，杜旺喜，王云贵：兰州职业技术学院生物工程系
杨芳萍，杨文雄：甘肃省农业科学院小麦研究所
杨随庄：西南科技大学生命科学与工程学院