基因克隆常用的工具酶
在基因克隆过程中，涉及基因的合成、切割、重组及修饰，在这些过程中，需要各种酶的参与。可以说，基因克隆技术的建立和发展是以各种核酸酶的发现和应用为基础的。目前，已经知道的工具酶种类繁多，功能各异，这里主要对聚合酶、内切酶、连接酶和修饰酶等几种常用的工具酶做下介绍。
1.DNA和RNA聚合酶
DNA 聚合酶最早被发现于大肠杆菌中，它们具有在引物存在条件下，以DNA 为模板，沿5′到3′方向，催化合成DNA 的功能。目前，常用的DNA 聚合酶有大肠杆菌DNA 聚合酶I（全酶）、Klenow 酶、T4 DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶及反转录酶等。DNA 聚合酶具有的共同特点为：不能起始新的DNA 链的合成，需要模板和引物，它们催化脱氧核糖核苷酸加到双链DNA 引物链的3′-OH 末端上，催化脱氧核糖核苷酸的聚合，合成新的DNA链。
目前，从大肠杆菌获得三种不同类型的DNA 聚合酶，即DNA 聚合酶Ⅰ、DNA 聚合酶Ⅱ和DNA 聚合酶Ⅲ。DNA 聚合酶Ⅰ和DNA 聚合酶Ⅱ被认为在大肠杆菌中主要是参与DNA的修复，而DNA 聚合酶Ⅲ则是与DNA 复制有关。在基因克隆中主要使用的是DNA 聚合酶Ⅰ。DNA 聚合酶Ⅰ是由大肠杆菌polA 基因编码的单链多肽，相对分子质量为109 kD。它具有三种不同催化活性，即5′-3′聚合酶活性、5′-3′外切酶活性和3′-5′外切酶活性。DNA聚合酶Ⅰ主要用途是通过DNA 端口平移制备用于核酸杂交分析的DNA 探针和对DNA 分子的3′突出末端进行标记。
Klenow 酶是大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理产生的大片段，它的相对分子质量为76 kD。与大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ相比，Klenow 酶缺少了5′-3′外切酶活性，保留了5′-3′聚合酶活性和3′-5′外切酶活性。
在基因克隆中，Klenow酶的主要作用为：
（1）补平限制性内切酶切割DNA 形成的3′末端；
（2）对DNA片段3′凹端进行放射性标记；
（3）合成cDNA第二链；
（4）用于Sanger双脱氧末端终止法中的DNA测序；
（5）用于体外诱导突变；
（6）也可用于PCR反应，进行体外扩增DNA序列。
T4 DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，由噬菌体基因43编码，相对分子质量为114 kD。该酶与Klenow 酶功能相似，具有5′-3′聚合酶活性和3′-5′外切酶活性，但其3′-5′外切酶活性比Klenow 酶强200 倍，且外切酶活性对单链DNA 的降解速度比降解双链DNA快得多。
T4 DNA聚合酶在基因克隆中的主要用途为：
（1）补平或标记由限制性内切酶酶切产生的3′凹端；
（2）对平末端或带有3′突出端的DNA分子的末端进行标记；
（3）利用T4 DNA聚合酶强大的3′-5′外切酶活性，使3′突出末端平端化；
（4）定点突变中第二联的合成及不依赖于连接反应的PCR产物克隆；(https://www.daowen.com)
（5）通过置换反应制备高比活的DNA杂交探针。
Taq DNA 聚合酶是一种耐热的DNA 聚合酶，它最初是从嗜热真菌（Thermus aquaticus）中分离获得，相对分子质量为6500 D。目前市售用于体外PCR 扩增特定DNA 序列的Taq DNA 聚合酶是在大肠杆菌中表达的重组蛋白。Taq DNA 聚合酶由于能耐受高温，因此把它用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对DNA 的特定片段进行体外扩增。在PCR过程当中，由于Taq DNA聚合酶在变性过程中不会失活，可直接进入下一轮循环，使它取代早期使用的Klenow 酶，成为PCR 中不可缺少的工具酶。Taq DNA 聚合酶虽具有5′-3′聚合酶活性，可是缺少3′-5′外切酶活性，因而不具有校正功能，导致扩增产物在序列上可能存在错误碱基，但错配效率大大低于正确配对的DNA 序列，故对大量PCR 产物分析不会引起太大的问题。后来，人们又发现一些极端耐热的DNA 聚合酶，其中有的性能已经超过Taq DNA聚合酶，且具有3′-5′外切酶校正功能。
反转录酶（reverse transcriptase）是依赖于RNA 的DNA 聚合酶。目前，已从多种RNA肿瘤病毒中分离到反转录酶，但使用最普遍的是来源于Moloney 鼠白血病病毒（M-MLV）的反转录酶和鸟类骨髓母细胞瘤病毒AMV 的反转录酶。反转录酶具有5′-3′聚合酶活性和RNaseH 活性。反转录酶的聚合作用所需模板可以是RNA，也可以是DNA，引物是带3′-OH 的RNA 或DNA。RNaseH 活性可以特异性地降解反转录酶催化合成的RNA-DNA 杂交链中的RNA链。
反转录酶是基因克隆中一种重要的酶，其主要用途为：
（1）构建cDNA文库和基因克隆；
（2）以单链DNA或RNA为模板合成核酸探针；
（3）代替其他酶，用于DNA测序。
RNA 聚合酶的作用是转录产生RNA 分子，需要DNA 模板，但无需引物。基因克隆中使用的RNA 聚合酶主要有三种：来源于SP6 噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌LT2 菌株的SP6噬菌体RNA聚合酶；来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌的T7噬菌体RNA聚合酶；以及来源于T3噬菌体感染的大肠杆菌的T3噬菌体RNA聚合酶。这三种RNA聚合酶都需要相应的特异性启动子，可以在体外大量合成与外源DNA一条链互补的RNA分子。
2.限制性内切酶
限制性内切酶是一类能识别双链DNA 分子中某一特定核苷酸序列，并能切割核酸分子内部磷酸二酯键的核酸内切酶。限制性内切酶最先从原核生物内发现，并从中分离纯化而来。
限制性内切酶的命名原则由H.Smith 和D.Nathams 于1973 年提出，1980 年Roberts 对其进行了系统分类，在实际应用中又进一步简化成目前的命名方法，其命名规则为：限制酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶来源微生物的属名；第二、三个字母（小写、斜体）代表微生物种名；第四个字母代表宿主菌的株或型；如果从同一种菌株内发现几种限制酶，则根据发现和分离的先后顺序用大写的罗马数字表示。
根据催化条件、识别和切割位点以及是否具备修饰酶活性等特点，限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型酶。Ⅰ型酶具有特异的识别位点，但无特异的切割位点，且切割是随机的，故此类酶酶切后不能产生特异性DNA 片段。Ⅱ型酶就是通常所指的DNA 限制性内切酶，这类酶种类较多。Ⅱ型酶通常以同源二聚体形式存在，且其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，它能识别双链DNA 的特殊序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA 片段。Ⅲ型酶数量较少，这类酶有特异的识别位点，但其切割点在识别位点序列外24～26 bp处，切割后也不能产生特异性的DNA片段，故在基因克隆中作用不大。
3.DNA连接酶
连接酶是基因克隆中必需的一类酶，当进行重组时，连接酶催化两个片段相邻的5′端磷酸基与3′端羟基之间形成的磷酸二酯键，形成重组核酸分子。在基因克隆中使用的DNA连接酶有T4 噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶两种。
T4 噬菌体DNA 连接酶是从T4 噬菌体感染的大肠杆菌中分离获得，是一种单链多肽酶，相对分子质量为68 kD。T4 噬菌体DNA 连接酶催化活性需要Mg2+作为辅助因子和ATP提供能量。T4 DNA 连接酶连接效率高，既可用于黏性末端连接，也可用于平末端连接，但是平末端连接效率比黏性末端连接效率低得多。平末端连接需要在10～20 ℃进行，且需较高的ATP 和T4 DNA 连接酶浓度，而黏性末端连接一般在16～26 ℃进行。大肠杆菌DNA 连接酶来自大肠杆菌，是相对分子质量为75 kD 的多肽链，催化需要NAD+作为辅助因子。该酶只能连接黏性末端DNA片段，不能连接平末端DNA。
4.DNA修饰酶
在基因克隆操作中，还可以用一些其他的酶对DNA 或RNA 进行修饰，以利于克隆的进行。如碱性磷酸酶可以特异地切除DNA 或RNA 5′末端的磷酸基团，防止载体自身环化；多聚核苷酸激酶可以催化人工合成的多核苷酸3′-羟基末端的磷酸化，为连接反应提供磷酸基团或用于寡核苷酸探针的末端标记；核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶在重组DNA时用于消除RNA 和DNA 的污染；末端脱氧核苷酸转移酶能够催化一种或多种核苷酸连接到DNA片段的3′-羟基末端形成同尾酶，而用于寡核苷酸探针的末端标记。