花粉管通道法导入高粱DNA创造优良小麦新品系的分子聚合育种[1]
花粉管通道法遗传转化等分子育种技术为拓宽小麦抗性基因资源和品质改良提供了新的途径。已有的研究结果表明，花粉管通道法介导的遗传转化及其后代能产生变异，已相继在40 多种作物上取得了显著成效；在国外SCI/EI 期刊也相继出现报道，并已获得大量优良小麦新品种。笔者也曾利用花粉管通道法将多种异源高粱基因组DNA 导入小麦，成功实现了小麦的抗条锈性、高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）以及品质性状的遗传改良。其中将高粱基因组DNA 导入受体甘麦8号，获得抗条锈变异系89144系列品系，部分品系已连续21年对混合菌和分生理小种条锈菌均表现免疫，抗锈机理分析显示89144在条锈菌侵染后表现出系统获得性抗性，HMW-GS 发生了突变，由受体的2+12 亚基变为5+10亚基，是优质且持久抗条锈病的优良种质资源。
为了能持续获得优质、抗锈小麦种质材料，拓宽小麦优质、抗条锈基因资源，本研究拟采用花粉管通道法，将抗逆性强、对条锈病免疫的C4作物高粱（Sorghum bicolor L.）基因组DNA 导入高感条锈病的稳定品系89122，以期引入高粱抗条锈基因，进行品质和产量性状改良，突出抗条锈、优质等目标性状的遗传改良，丰富优质、抗条锈小麦基因和种质资源，为花粉管通道法外源DNA导入的分子育种研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供体材料：高粱，禾本科高粱属，体细胞染色体数目2n=20，分蘖旺盛，根系发达，抗旱，耐盐碱，适应性广，对条锈病免疫。
受体材料：稳定的春小麦品系89122，2n=42，叶宽，旗叶下披，红粒，籽粒粉质，分蘖成穗率中等，耐盐碱，高感条锈病，品质较差（由甘肃省农科院生物技术研究所采用花粉管通道法育成的粉质春小麦品种）。
1.2 试验方法
1.2.1 供体总DNA的提取
采用CTAB 法，按照刘学春等报道的方法，提取供体高粱基因组DNA，紫外分光光度计检测，A260/A230=2.13＞2.00，A260/A280=1.87＞1.80；琼脂糖电泳呈单一区带，无拖尾现象，表明所提纯的DNA分子量在50 kb以上，蛋白质等杂质已去除干净，达到作物DNA导入所要求的纯度。基因组DNA 溶于1×SSC 溶液，4 ℃冰箱储存，导入前用蒸馏水稀释至300 μg·mL-1。
1.2.2 供体高粱基因组DNA的导入及后代的处理与选择
供体高粱基因组DNA的花粉管通道法导入参考倪建福等的方法。
待导入穗形成幼胚后，记作D0代种子。取其15～20 d 胚龄的幼胚进行幼胚培养，于MS培养基上直接诱导幼胚成苗（D1），并于温室加代选择，所获D1及D2代种子点播于单株选择圃，选择各种变异株，按单株收取种子；自D3代起播种于株系选择圃，选择优良稳定变异株系。D4～D6代依次参加高代产量比较、鉴定试验等各级试验，逐代筛选优良品系。自D1代起进行生物学特性的观察、记载和统计分析，并同步进行产量、抗病性、品质鉴定、生理生化及分子鉴定。
1.2.3 产量鉴定
D4～D6代参加各级观察和产量鉴定试验；2007—2008 年参加甘肃省春小麦区域试验；同时进行多年多点生产示范及适应性分析。
1.2.4 抗条锈性鉴定
自D1代起，连续对供体、受体及后代变异株采用新叶涂抹法进行混合菌条锈菌孢子粉田间人工接种，成株期条锈病鉴定。自D6代委托省级作物抗病性鉴定机构进行混合菌和新强毒菌株分生理小种的苗期和成株期条锈病鉴定。条锈病记载及分级标准采用国家质量技术监督局1995年颁布的《小麦条锈病测报调查规范》。
1.2.5 品质分析
自D6代委托省级作物品质化验分析机构进行各项品质指标的化验分析。
1.2.6 高分子量麦谷蛋白亚基鉴定
高分子量麦谷蛋白亚基检测参考倪建福等报道的方法，略有改动。
1.2.7 过氧化物酶分析
供试样品过氧化物酶活性测定参考《现代植物生理学实验指南》1999 年版报道的方法。
1.2.8 统计与分析
所获生物学性状等可定量数据的观察和统计均重复3次以上，取其平均值。
图1 外源DNA导入小麦D1代幼胚离体培养及再生幼苗
注：图A 示幼胚脱分化形成愈伤组织；图B示愈伤组织分化成苗；图C示完整幼苗
2 结果与分析
2.1 外源DNA导入小麦D1代幼胚离体培养及温室加代
外源基因组DNA 导入后的D1代种子由于灌浆不充分，其萌发率较低，大量可能的变异后代因不能正常萌发成苗而遗失，是提高其变异率的制约因素。
本研究经对外源高粱DNA导入受体小麦89122的D1代幼胚的离体培养研究，获得了适宜取材时间、最适培养基及培养条件、幼苗移栽炼苗、温室栽培条件等关键技术信息，结果显示幼胚取材适宜胚龄期为10～15 d，幼胚大小约1.5 mm，D1代幼胚培养存在幼胚直接成苗和愈伤组织途径两种成苗途径，虽然幼胚直接成苗率较低（24.1%），但幼胚愈伤诱导率高达74.6%，最终愈伤分化成苗率达90.4%，移栽成活率99.2%，温室可结实率100%，D2代植株成本较原有技术仅增加3.4%，不但挽救了少数因不能直接形成可育种子而导致的无效导入后代，而且缩短了变异稳定时间，达到了幼胚挽救和温室加代稳定的目标（叶春雷等，2007）。
图2 外源DNA导入受体89122及变异系2001502-23的生物学性状的比较
Fig.2 Comparison of biological characteristics of receptor 89122 introduced exogenous DNA and variants 2001502-23
注：A.受体89122；B.变异系2001502-23。
图3 外源DNA导入受体89122及变异系2001502-23的籽粒性状比较
Fig.3 Comparison of grain traits of receptor 89122 introduced exogenous DNA and variants 2001502-23
注：A.受体89122；B.变异系2001502-23。
2.2 生物学性状分析
外源DNA 供体高粱、导入受体89122 及变异系2001502-23 的生物学性状分析显示，新品系2001502-23的生物学性状较受体89122出现不同程度的变异（见表1）。
（1）导入新品系2001502-23 的生育期、单株粒重、千粒重等农艺性状介于外源DNA供体高粱与受体小麦89122之间，但多偏向于受体；部分性状，如芒、生育期等与受体接近。这与以往的研究结果类似。
（2）导入新品系2001502-23 的分蘖数、单株粒重均较受体89122 有所增加，而株高、穗长、千粒重、旗叶面积等受体89122有所减小，尤其是单株穗数和分蘖力明显增加，这与在后期产量鉴定中表现出的产量群体优势相一致。(https://www.daowen.com)
（3）受体89122旗叶下披，叶面积大，但功能期较短；而导入新品系2001502-23的旗叶叶型上举，单个叶面积缩小，叶功能期长，空间间隙增加，提高了整体光合效率，这也与其分蘖数高、后期产量优势相一致。
（4）受体89122 籽粒红色、粉质，落黄较差；而导入新品系2001502-23 的株高适中，籽粒白色、硬质，落黄性好，虽表现晚熟，但籽粒灌浆快，表现出明显的生产适应性优势。
表1 外源DNA供体、导入受体与后代新品系的生物学特性及主要农艺性状的统计与分析
Table 1 The statistics and analysis on biological characteristics and agronomic traits of the exogenous DNA donor，receptor and new lines
上述结果说明，后代变异系2001502-23 的部分生物学性状较受体89122 变异程度大；穗长、千粒重等产量性状比较稳定，变异相对较小；生育期等性状易受环境影响，变异也不明显。这些结果可能是外源高粱DNA导入受体89122引起了相应基因表达的变化所致。
2.3 产量鉴定
各级产量试验结果显示，后代新品系2001502除在甘肃省品种区域试验中产量较受体89122低外（原因可能是区域试验选点不完全发挥该品种增产潜力所致），鉴定试验以及生产示范试验均较受体89122分别增产17.24%、5.18%、52.42%（见表2），说明外源DNA导入受体后使其产量性状得到明显改善。
表2 外源DNA供体、导入受体与后代新品系的各级试验产量比较
Table 2 Comparison of the yield of the exogenous DNA donor，receptor and new lines in various tests
注：“/”表示该项未测定。
Note:“/”indicates untested item.
2.4 抗条锈性鉴定
经连续田间成株期人工接种条锈菌混合菌鉴定结果显示，后代新品系2001502-23 连续8年对条锈病表现免疫；而供体高粱对条锈病免疫，受体89122则自1998年起逐渐对条锈病丧失抗性（见表3），其反应型从1998年的2型增加至4型。
图4 后代2001502-23和受体89122田间成株期人工接种条锈菌混合菌下的感病程度
Fig.4 The rust-resistance degree of variants 2001502-23 and recep
D6代混合菌和新强毒菌株分生理小种的苗期和成株期条锈病鉴定结果显示（见表3）：新品系2001502-23苗期对混合菌，成株期对水4、水7、水14、HY8、条中32和混合菌均表现免疫；而供体高粱经鉴定对条锈病免疫，导入受体89122经苗期混合菌和成株期分生理小种鉴定显示均表现高感条锈病（反应型4 型）。上述结果证明，采用花粉管通道法将外源高粱DNA导入高感条锈病的受体小麦89122后，实现了小麦抗条锈性状的恢复和高粱抗条锈基因向小麦的转移。
表3 2002—2008年外源DNA供体、导入受体与后代新品系的条锈病抗性鉴定与比较
Table 3 The identification of resistance to stripe rust of the exogenous DNA donor，receptor and new lines in 2002—2008
注：记载标准采用0～4级分类法，记载项目为反应型/严重度/普遍率。
Note:The 0-4 level taxonomy is used in recording.Recording items are reaction type/severity/prevalence rate.
2.5 籽粒和面粉品质分析
外源DNA 供体、导入受体与后代新品系的籽粒营养及加工品质分析结果显示（见表4），外源DNA 导入新品系2001502-23 的容重、蛋白质含量、籽粒粗蛋白含量、赖氨酸含量等较导入受体89122和DNA供体高粱均出现不同程度的增加。排除高粱作为杂粮作物本身的品质指标较低外，导入新品系2001502-23 较导入受体89122 的粗蛋白含量提高17.56%，容重提高3.80%，赖氨酸含量提高9.11%，品质类型均属于中筋小麦，籽粒品质得到明显改善，进一步证明高粱外源基因导入小麦引起了相应基因表达和蛋白质等籽粒和面粉品质性状的变化。
表4 外源DNA供体、导入受体与后代新品系的籽粒营养及加工品质的比较与分析
Table 4 The grain nutrition and processing quality of the exogenous DNA donor，receptor and new lines
注：“/”表示该项未测定。粗蛋白含量、赖氨酸含量和淀粉含量的折算以籽粒干物质重为基础，湿面筋含量和Zeleny沉淀值的折算以籽粒含水14%为基础。
Note: “/”indicates untested item.The contents of crude protein，lysine and starch are based on dry matter of grains，while the wet gluten content and Zeleny sedimentation value are based on grains with 14%water.
2.6 高分子量麦谷蛋白亚基鉴定
HMW-GS 检测结果显示：后代新品系2001502-23 含有7+8、5+10 优质亚基，与导入受体89122（含有7+8、2+12 亚基）相比，HMW-GS 发生明显变异，Gul D1 位基因发生等位变异，其表达产物由原来（89122）的2+12 亚基变为5+10 亚基（图5），但高粱种子贮藏蛋白中并没有亚基5+10，从而实现了麦谷蛋白亚基的改良。这与倪建福等（2005）报道的高粱基因组DNA 的导入春小麦甘麦8 号的后代89144 的HMW-GS 基因变异情况相同。这种相同的异源供体基因组DNA 导入不同小麦材料产生了相同的变异情况，其可能的原因是异源高粱基因组DNA 的导入对受体基因组中HMW-GS 基因的生物诱变机理和效果相同。
图5 外源DNA导入受体与后代新品系的HMW-GS组成的比较
Fig.5 The HMW-GS composition of the exogenous DNA donor，receptor and new lines
注：a.89122；CS.中国春；b.2001502-23；c.2001502-25；m.小偃54。
Note:a.89122；CS.Chinese Spring；b.2001502-23；c.2001502-25；m.Xiaoyan54.
2.7 过氧化物酶电泳分析
经过氧化物酶电泳结果显示，新品系2001502-23 在条带a、b、c、d、e、f、g 等处与导入受体89122存在差异，在条带a等几处明显与外源DNA 供体高粱相同（图6），说明其过氧化物酶较导入受体89122发生明显变化。而过氧化物酶等蛋白质的类型是相关基因表达的产物，这也进一步证明外源高粱DNA导入受体小麦89122后引起了相应的过氧化物酶基因表达的变化。
图6 外源DNA供体、导入受体与后代新品系的过氧化物酶电泳分析
Fig.6 The analysis on EST-PAGE of the exogenous DNA donor，receptor and new lines
注:1.89122；2.2001502-23；3.高粱.Note:1.89122；2.2001502-23，3.Sorghum bicolor.
2.8 适应性分析
后代新品系2001502-23与导入受体89122在各地区的适应性分析显示，外源春小麦新品系2001502 适合在甘肃省兰州、武威、白银、定西以及宁夏、青海等年降雨量500 mm左右的水旱地示范推广，而受体89122适宜在甘肃省高寒阴湿地区进行地膜栽培以及中度盐碱地种植。这说明外源DNA 导入引起了受体小麦生物学性状及生理机制的变化，导致其地区适应性的相应变化。
3 讨论
本研究将高粱基因组DNA导入高感条锈病、籽粒粉质的稳定小麦品系，获得1个稳定的优良变异新品系，较供体高粱和受体小麦生物学性状发生明显变异和改良，对条锈病免疫，HMW-GS发生明显变异，Gu1 D1位点基因发生等位变异，其表达产物由原来（89122）的2+12亚基变为5+10亚基，但高粱种子贮藏蛋白中并没有亚基5+10，多项品质指标得到改良，过氧化物酶表达发生明显变化，地区适应性结果也说明高粱基因组DNA 导入小麦引起了相应基因表达的变化，实现了高粱抗条锈基因和HMW-GS 基因的转化和多基因聚合，达到了目标性状遗传改良的目的。推测该新品系优良性状的产生是供体DNA 导入并发生重组的结果。
笔者认为花粉管介导的异源高粱DNA 导入完全可以实现包括抗条锈基因、HMW-GS基因在内的遗传转化、多基因聚合和目标性状遗传改良，这对促进属间基因交流，扩展小麦基因资源具有重要的科学意义。
参考文献（略）
欧巧明，崔文娟，王炜，倪建福，王红梅，杨芳萍，罗俊杰：
甘肃省农业科学院生物技术研究所