利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量[4]
大麦（Hordeum vulgare）作为继玉米（Zea mays）、水稻（Oryaa sativa）、小麦（Triticum aestivum）之后的第四大禾谷类作物，被广泛应用于工农业生产，其中最重要的用途是制成麦芽以酿造啤酒。籽粒蛋白质含量是啤酒大麦的一个重要籽粒品质指标。优质啤酒大麦要求蛋白质含量一般为9%～12%，欧洲酿造协会对大麦籽粒蛋白质含量要求不超过11.5%。有研究表明，籽粒蛋白质含量与麦芽浸出率呈负相关，籽粒蛋白质含量过高，会显著降低麦芽浸出率。同时，也会延长浸麦时间，降低麦芽汁过滤速度，影响啤酒的清澈度以及啤酒泡沫的稳定性。而目前国产啤酒大麦蛋白质含量在12.5%以上，与进口大麦相比，其蛋白质含量一般高出2%，已成为中国啤酒大麦产业健康、持续发展的限制因素。过量施用氮肥和失衡施肥不仅导致蛋白质含量偏高，而且加剧环境污染。因此，培育高氮肥水平低蛋白质啤酒大麦新品种具有十分重要的现实意义和应用前景。
目前，采用RNAi 抑制B 组醇溶蛋白基因表达改良大麦酿造品质的研究尚未见报道。本研究应用Gateway 技术构建大麦醇溶蛋白基因RNA 干扰表达载体。以大麦B-hordein 为靶基因，利用RNA 干扰技术抑制其表达，降低大麦籽粒中蛋白质含量，以期在高氮肥水平筛选出低蛋白质啤酒大麦新种质，探索大麦品质改良育种新途径。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
以甘肃省农业科学院经济作物与啤酒原料研究所大麦课题组提供的大麦品种Golden Promise为转基因受体材料。2010年5月于甘肃省农业科学院兰州试验田取授粉后12～14 d的幼胚用于遗传转化。T1～T3转基因材料在温室中种植。2013年4—6月于甘肃省农业科学院生物技术研究所转基因温室开展氮肥运筹试验。
1.2 试验材料
大肠杆菌DH5α，由甘肃省农业科学院生物技术研究所遗传工程实验室保存。农杆菌菌系AGL-1，由中国农业大学肖兴国老师惠赠。Gateway 入门载体pDONR207（specr）、目的载体pBract207（Kanr），均由英国JIC Wendy 博士和Mark Smedley 馈赠。Gateway 重组酶试剂盒、RNA 提取试剂Trizol 和反转录试剂盒购自Invitrogen 公司。高保真DNA 聚合酶，限制性内切酶购自TaKaRa 公司。DNA 凝胶回收试剂盒、DNA marker、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒，购于TIANGEN 公司。引物，由上海英俊生物公司合成。其他试剂，购自国内生物试剂公司，均为分析纯。
1.3 试验方法
1.3.1 B-hordein片段的克隆
通过BLAST 在线分析，找出大麦B 组醇溶蛋白基因（gi:18928）核心保守序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计扩增B-hordein 片段的引物BBH-FBBH-R（表1），为便于后续载体构建，在正向和反向引物5′端分别添加attB1和attB2位点序列。然后参照TIANGEN公司Plant Genomic DNA Kit方法从大麦新鲜叶片中提取基因组DNA作为模板，进行B-hordein目的片段扩增。反应体系为0.5 μL DNA （约10 ng）、2 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，20 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL、2.5 μL 10×PCR buffer、1 U DNA 聚合酶，超纯水补足至25 μL。扩增程序为94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃1 min，72 ℃1 min，30 个循环；72 ℃10 min，10 ℃保存。克隆片段连接到T 载体并送交公司测序。测序结果与大麦B 组醇溶蛋白基因进行同源性比对分析。
表1 试验所用的引物及其序列
Table 1 Primer pairs used in this study
注：BBH-F/BBH-R 引物序列下划线部分分别为attB1 和attB2 位点序列。
Note：The underline of BBH-F/BBH-R were site sequence of attB1 and attB2 respectively.
1.3.2 利用Gateway技术构建RNAi载体
用回收纯化后的带有接头的PCR 产物与受体载体pDONR207 进行BP 反应。取测序结果正确的阳性克隆菌液提取质粒作为入门载体克隆，紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测质粒的浓度和纯度。然后根据试剂使用说明，用LR 克隆混合酶进行入门载体和目的载体pBract207 的LR 反应。为检测RNA 干涉区段是否同时正确插入到目的载体的2 个位点，提取质粒并纯化，分别用限制性内切酶进行酶切鉴定。所构建的植物表达载体命名为pBract207-zz-gp4（图1）。
图1 pBract207-zz-gp4 植物表达框架示意图
Fig.1 Structure map of pBract207-zz-gp4 expression vector
RB：右边界；NOS-ter：NOS 终止子；att1 pENTR：入门载体att1；anti-gp4：反向gp4；att2 pENTR：入门载体att2；IV2 intron：IV2 内含子；i18 intron：i18 内含子；gp4：正向gp4；Ubi P：Ubi 启动子；CaMV T：CaMV终止子；Hyg：潮霉素B磷酸转移酶基因；35S P：35S启动子；LB：左边界
RB:Right border；NOS-ter:NOS terminator；att1 pENTR:att1 from pENTR；anti-gp4:gp4 in antisense oritention；att2 pENTR:att2 from pENTR；IV2 intron；i18 intron；gp4:gp4 in sense oritention；Ubi P:Ubi promoter；CaMV T:CaMV terminator；Hyg:Hygromycin B phosphotransferase gene；35S P:35S promoter；LB:Left border
1.3.3 大麦遗传转化及植株再生
采用直接导入法将pBract207-zz-gp4 导入农杆菌AGL-1，获得用于进行大麦转化的农杆菌工程菌。大麦幼胚培养、农杆菌介导的遗传转化、抗性愈伤组织的筛选、植株的再生及移栽按照文献方法进行。
1.3.4 转基因大麦的PCR检测及Southern杂交鉴定
采用CTAB 法提取T1幼苗及对照植株基因组DNA。为检测干扰框架转入与否，分别设计扩增潮霉素基因引物HygF/HygR、正向反应的引物UbiProF1 和i18intronR1、反向反应的引物I V2intronF1 和NosTermR1（表1）。以提取的大麦基因组DNA 为模板，分别用上述3对引物进行PCR扩增，筛选转基因株系，反应体系同1.3.1，扩增程序中除Hyg同上外，正反向反应退火温度设置为：48 ℃（正）/46 ℃（反），各38 个循环。在此基础上对转基因后代进行了Southern blot 验证。干涉片段为大麦内源基因B-hordein 片段，Southern 杂交以内含子部分序列为DNA 探针，XhoⅠ酶切PCR 检测阳性的转基因大麦基因组DNA，参照Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitI（货号：11745832001）说明书操作。
1.3.5 RT-PCR检测B-hordein表达水平
采用Trizol 试剂提取PCR 阳性植株和非转基因植株花后10、15、20 和25 d 的籽粒RNA，加入DNAaseI（RNase Free，TaKaRa）除去所提RNA 中残存的基因组DNA，并用紫外分光光度计对各样品RNA 进行精确定量后，参照Invitrogen GoldScript cDNA 合成试剂盒（货号：c81401190）合成cDNA 第一链。以大麦actin（gi：24496451）为内参，采用其特异引物BAF/BAR 对各样本cDNA 均一化，进行转基因大麦灌浆期籽粒B-hordein RT-PCR表达分析，B-hordein 引物为BHF/BHR，序列见表1。反应体系同1.3.1，扩增程序为：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃（actin）/44.2 ℃（B-hordein）30 s，72 ℃1 min，28（actin）/30（B-hordein）个循环；72 ℃10 min ，10 ℃保存。将对照（Golden Promise）的比率设为100.00%，用Image Lab 4.1 图像分析软件分析各时期转基因籽粒目的基因的相对含量。
1.3.6 转基因大麦蛋白质含量测定、SDS-PAGE检测
转基因大麦籽粒收获后，种子数量有限，为不损伤种子以进行后续研究，采用近红外谷物分析仪（Foss Tecator，Infratec 1241，Grain Analyser v.3.40）测定蛋白质总含量，每个样品重复测定3次，取平均值进行分析。
取T3转基因大麦及对照单粒种子，称重，用样品钳夹碎，放入1.5 mL离心管，按1 mg加8 μL 的比例加入醇溶蛋白提取液（每100 mL 含甲基绿0.05 g，2-氯乙醇25 mL），摇晃均匀后，室温浸提过夜，10000 r/min 离心10 min，上清液为醇溶蛋白样品。运用SDSPAGE （12.5%的分离胶，2.5%的浓缩胶）检测基因大麦籽粒醇溶蛋白组分。每个样品上样量为15 μL。将对照（Golden Promise）B 醇溶蛋白比率设为100.00%，用Image Lab 4.1图像分析软件分析各转基因籽粒B醇溶蛋白相对比例。
1.3.7 施氮水平和方式对转基因大麦蛋白质含量的影响
选取蛋白质含量降低的RNAi 株系和未转基因材料点播于花盆（22 cm×28 cm×30 cm）中，其中，蛭石∶草炭土= 2∶1。每处理3 盆，5 株/盆，置于转基因温室进行常规管理：23 ℃/18 ℃（昼/夜），16 h/8 h（光/暗）播种前施以基肥尿素和磷肥（P2O5 180 kg·hm-2）。试验共设置2 个水平。A：3 种氮肥水平，低氮160 kg·hm-2（low nitrogen dosage，LN），中氮230 kg·hm-2 （normal nitrogen dosage，NN），高氮300 kg·hm-2 （high nitrogen dosage，HN）；B：在高氮肥水平，设置3种施氮方式，HN1 300 kg·hm-2基肥，HN2 300 kg·hm-2（基肥施2/3、分蘖期各追肥1/3），HN3，300 kg·hm-2（基肥、分蘖期和拔节期追肥1/3）。籽粒成熟收获后进行蛋白质含量测定和醇溶蛋白SDS-PAGE检测。
1.3.8 转基因大麦农艺性状调查和方差分析
Golden Promise RNAi 转基因大麦后代材料按株系种植，每个株系种植1 行，行长1 m，随机区组排列，3 次重复，每重复中包含1 个受体对照。生长期间调查抗病性及抽穗期、开花期等，成熟期从每小区随机取2个株系材料，测量株高、穗长、穗粒数、千粒重等主要农艺性状，全部资料汇总后利用DPS数据处理软件进行方差分析。
2 结果
2.1 目的基因片段的获得及序列分析
以目前甘肃推广面积较大的甘啤4 号和甘啤5 号DNA 为模板，用引物BBH-F/BBH-R通过PCR同源克隆得到2条特异条带（图2-A）。测序结果表明：该片段大小为349 bp。软件分析表明，该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性达92% （图2-B），与该基因已登录的mRNA 序列同源性高于98%（图2-C）。其中，甘啤4 号（Gp4）片段跟甘啤5 号（Gp5）片段同源性为98%，确认所得的片段为大麦醇溶蛋白基因片段（图2-B）。
2.2 转基因大麦的获得及分子检测
通过工程菌株AGL-1/pBract207-zz-gp4转化Golden Promise 幼胚共获得28株阳性转基因植株。移栽温室后，其中23 株正常成熟并结实，收获T1种子。以23 株转化株T1幼苗进行PCR检测，11株含有Hyg片段和完整的RNAi构件。
为进一步验证转基因植株，随机选取8株PCR 检测呈阳性的T2和T3植株，用地高辛标记298 bp的intron探针进行Southern杂交检测。结果表明，阴性对照无杂交信号，所测的8个转基因株系中6个株系有杂交带。说明6个大麦转基因株系的基因组中已整合了RNAi构件，并且每个转基因植株整合了1～2个拷贝的外源基因（图3）。
图2 B-hordein片段的克隆和序列分析
Fig.2 The PCR amplication of B-hordein fragments，cluster analysis and sequence alignment
A：B-hordein 片段PCR 扩增；B：克隆片段Gp4/Gp5 与部分已登录B-hordein 聚类分析；C：B-hordein保守区与该基因mRNA序列比对
A: The fragments of B-hodein using PCR amplication；B:Cluster analysis between cloned fragments of Gp4/Gp5 and B-hordeins logged in GenBank；C:Sequence alignment between conserve region and mRNA of B-hordein
(https://www.daowen.com)
图3 T2/T3转基因植株Southern 杂交分析
Fig.3 Southern blotting analysis of T2/T3transgenic lines
P：阳性质粒对照；Wt：非转基因植株；1、3、5：T3转基因株系；2、4、6：T2转基因株系
P: Plasmid positive control；Wt: Non-transgenic plant；1，3，5: T3transgeniclines；2，4，6: T2transgenic lines
2.3 转基因大麦灌浆期T3籽粒的RT-PCR分析
花后10、15、20、25 d 随机取6 株（株系R4、R8、R15、R19 来自T1RNAi-22，R14、R17 来自T1RNAi-20）转基因大麦T3单株籽粒，采用半定量RT-PCR 方法，对各转基因单株B-hordein 转录表达进行动态分析（图4）。结果表明，用内标引物从各株系籽粒cDNA都扩增到540 bp 左右亮度相当的条带（图4-A），与预期的actin 片段大小相符，说明用于PCR扩增的cDNA模板量是一致的。
用Image Lab 4.1 图像分析软件分析所得的半定量RT-PCR 电泳图，把非转基因对照CK的比率设为100.00%，并与其他各时期转基因植株比较。取3次平均值作折线图（图4-B）。各RNAi 株系B-醇溶蛋白基因转录于籽粒发育初期（花后0～10 d）开始表达，至15 d转录表达量最高；15～20 d转录表达量逐渐下降，并且20 d RNAi株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%～55.19%，而且在各时期中也最低；25 d 时RNAi 株系表达量较同期对照降低17.80%～40.33% （图4-B）。说明RNAi 在转录后发生了作用，抑制了B 醇溶蛋白基因表达。
图4 花后不同发育时期T3转基因大麦籽粒B-hordein转录表达
Fig.4 Development expression pattern of B-hordein in T3transgenic barley after flowering
A：花后不同发育时期T3转基因大麦籽粒B-hordein的RT-PCR 分析；Wt：非转基因植株；TN：转基因阴性对照；R4、R8、R14、R15、R17 和R19 为T3转基因大麦；ddH2O：阴性对照。B：花后不同时期T3转基因籽粒B-hordein的RT-PCR分析
A: Semi-quantitative RT-PCR analysis of B-hordein of T3transgenic barley after flowering；Wt: Non-transgenic plant；TN: Transgenic negative plant；R4，R8，R14，R15，R17，R19: T3transgenic barley；ddH2O:Transgenic negative plant.B:Development expression pattern of B-hordein in T3transgenic barley after flowering
2.4 转基因大麦籽粒蛋白质含量测定及SDS-PAGE检测
对获得的T1转基因大麦籽粒蛋白质含量采用近红外谷物分析仪进行测定，结果表明，2 个转基因株系RNAi-20、RNAi-22 蛋白含量较非转基因对照降低4.9%～7.3%，最低达到11.4%，同期Golden Promise 蛋白质含量为12.3%。对这两个株系后代材料（经PCR 验证含有RNAi 构件）进一步分析，RNAi-20 和RNAi-22 8 份T3材料籽粒总蛋白质含量平均为12.8%，较非转基因对照降低2.2%～11.6%（图5）。
图5 T3转基因大麦籽粒蛋白质含量分析
Fig.5 Analysis of the protein content of T3 transgenic barley
注：不同大写字母表示差异极显著（P≤0.01）。
Note:The column with different letter are highly significant different （P≤0.01）.
提取RNAi-20和RNAi-22 8份T3转基因大麦及对照籽粒醇溶蛋白进行SDS-PAGE 检测（图6）。结果表明，与对照相比，转基因大麦籽粒B-醇溶蛋白条带亮度整体减弱，而且其中一条带亮度极弱（箭头所示）。
图6 T3转基因大麦籽粒醇溶蛋白SDS-PAGE电泳结果
Fig.6 SDS-PAGE of the extracted endosperm hordeins from single de-embryonated seeds in T3 grain
M：蛋白质分子量标准；Wt：非转基因植株；R1～R8：转基因大麦RNAi-20、RNAi-22 T3籽粒；C、B、A位置代表醇溶蛋白各组分
M: Protein molecular weight marker；Wt: Non-transgenic plant；R1-R8: T3seeds of RNAi lines R1-R8 from RNAi-20 and RNAi-22.The positions of the C，B and A hordeins are indicated
用Image Lab 4.1 软件分析所得的SDS-PAGE 电泳图，把非转基因对照B 组各条带比率定为100.00%，并与其他各RNAi株系比较，取3次平均值作柱状图（图7）。从SDS-PAGE数据可以看出，相比对照RNAi 各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低，其中R4、R5 和R6株系B-醇溶蛋白比率降低明显，平均减幅为49.42%。
图7 T3转基因大麦籽粒B醇溶蛋白SDS-PAGE相对比例分析
Fig.7 Semi-quantitative analysis of B-hordein of SDS-PAGE in T transgenic barley
Wt：非转基因植株；R1～R8为转基因大麦RNAi-20、RNAi-22 T3代籽粒。图中数据为B-醇溶蛋白各条带以对照为参照所得相对比例平均数。B1、B2 和B3 分别表示SDS-PAGE 电泳图中B-醇溶蛋白三组条带，其顺序按照分子量大小由高到低排序
The data were mean of ratio of different RNAi group to positive control group.B1，B2，B3 indicate the three bands showed on the SDS-PAGE image，which ordered as the molecular weight from high to low
2.5 不同氮肥处理对转基因大麦的影响
为验证RNAi 转基因大麦高氮肥水平下蛋白质含量变化，对5 种氮肥处理所收获的籽粒进行了蛋白质含量测定和醇溶蛋白SDS-PAGE 检测。结果表明：在高氮肥水平HN2与HN3处理中，转基因大麦RNAi-20蛋白质含量显著低于对照（表2）。而且施用等量高氮肥时，随着氮肥后移（HN2到HN3），与未转基因对照相比，转基因大麦总蛋白含量逐渐降低（图8）。
表2 不同施肥水平和方式对转基因大麦蛋白质含量的影响
Table 2 The effect of different nitrogen dosages and application methods on grain protein content in transgenic barley
注：表中数据为平均数±标准误。同一列不同大写字母表示差异极显著（P≤0.01）。
Note：The data were mean±SE.Values in the same column followed by different letters are highly significant different （P≤0.01）.
图8 高氮肥水平3种施氮肥方式对转基因大麦蛋白质含量的影响
Fig.8 The effect of high nitrogen dosage on grain protein content of transgenic barley
醇溶蛋白SDS-PAGE检测结果表明（图9），在5种氮肥处理下，转基因大麦B-醇溶蛋白条带亮度均弱于对照，且转基因大麦在HN3处理中，与对照相比，该条带亮度极弱。
图9 T1转基因大麦不同氮肥处理下醇溶蛋白SDS-PAGE电泳结果
Fig.9 SDS-PAGE analysis of the extracted endosperm hordeins from single de-embryonated seeds of control and T1 transgenicbarley in different nitrogen treatments
M：蛋白质分子量标准；LN、NN、HN1、HN2、HN3表示各氮肥处理下非转基因植株；TLN、TNN、THN2、THN3表示各氮肥处理下转基因大麦；C、B、A位置代表醇溶蛋白各组分
M:Protein molecular weight marker；LN，NN，HN1，HN2，HN3 stand for different nitrogen management of non-transgenic plant；TLN，TNN，THN2，THN3stand for different nitrogen management of transgenic barley；The positions of the C，B and A hordeins are indicated
2.6 转基因大麦的农艺性状分析
成熟期随机取2 株系进行主要农艺性状调查，对统计数据进行方差分析，结果表明，重复间没有显著差异，而转基因株系与对照间存在显著差异。转基因株系RNAi20 和RNAi22穗长、穗粒数与对照相比差异不显著，而株高、千粒重显著低于对照（表3）。
表3 转基因大麦主要农艺性状
Table 3 Major agronomic characteristics of transgenic barley
注：表中数据为平均数±标准误。同一列中小写字母表示在0.05水平上差异显著（P≤0.05）。
Note：The data were mean±SE.Values followed by different letters are significantly different among lines at 0.05 probability levels.
3 结论
RNAi 技术能抑制籽粒B-hordein 表达，降低B-醇溶蛋白含量，高氮肥水平能显著降低大麦蛋白质含量，改良大麦品质，创新优良大麦种质。
参考文献（略）
李静雯，李淑洁：甘肃省农业科学院生物技术研究所
张正英：甘肃省农业科学院
令利军：西北师范大学生命科学院