甘肃小麦种质资源1BL/1RS易位系和HMW-GS分子检测及品质性状分析[4]
摘要：小麦1BL/1RS易位系和高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）是影响小麦加工品质的重要因素。为了明确甘肃小麦品种资源中1BL/1RS易位系的分布和HMW-GS 组成情况，本研究采用多重PCR 体系对552 份小麦引进品种、育成品种和高代品系进行分子检测，分析了1BL/1RS 和非1BL/1RS 易位品种的容重、蛋白质、湿面筋、赖氨酸含量、SDS沉淀值等品质参数。结果表明：供试材料中检出1BL/1RS易位系202 份，占总数的36.6%，冬小麦育成品种中易位系的分布频率（51.8%）显著高于引进品种（41%）和春小麦（31.1%）。Glu-1 位点优质亚基Ax1/Ax2*、Dx5、Bx14 和Bx7OE 的分布比例依次是66.2%、52.5%、13.5%、1%，聚合多个优质亚基基因（位点）的品种频率较低。1BL/1RS易位和非1BL/1RS易位品种容重和沉淀值的参数差异达到显著水平（P＜0.05）。在遗传背景相似的情况下，Glu-B3 位点的正常表达及Dx5优质亚基对1BL/1RS易位导致的品质变差有补偿作用。本研究结果对提高甘肃小麦品质改良效率具有科学指导意义和参考价值。
在小麦品质改良中如何快速、准确判定小麦遗传背景中是否有1BL/1RS 易位系及HMW-GS 的类型和组成情况，对评价和选育强筋小麦品种具有重要的现实意义。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecylsulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）是分离和鉴定HMW-GS 的传统方法，该方法能一次检测出待测材料的所有亚基，但不能有效鉴别分子量大小和迁移率十分接近的亚基，对操作技术要求高，费工费时。近年来，随着愈来愈多的HMW-GS 和LMW-GS 等位基因被克隆，其相应的分子标记也不断被发展起来，迄今已相继建立了Dx5、AxNull、Glu-B3、Bx7OE、Glu-A3d 和Glu-B3i 等优质亚基的分子标记。通过分子标记辅助选择可以加快优质亚基在同一品种的聚合，而与单一PCR 方法相比，多重PCR 一次可以同时检测多个目标基因，具有低成本、高效率等优点，国内外学者已先后开发了针对不同目标性状的多重PCR体系，可用于小麦品种或育种后代麦谷蛋白亚基基因的鉴定和分子标记辅助选择。
关于甘肃小麦地方种质资源和早期育成品种的HMW-GS 组成与品质性状有一些研究，认为甘肃小麦种质Glu-1 位点组成比较单一，遗传基础相对狭窄，优质亚基5+10 等频率低。但是甘肃小麦品种资源中1BL/1RS易位系的分布及利用情况还未见报道，尤其是新育成品种和大面积推广品种的HMW-GS 组成及1BL/1RS 易位的情况尚不清楚，育种亲本选配存在一定的盲目性。因此，本研究广泛收集近年来甘肃小麦新育成品种、高代品系及骨干亲本材料，采用STS 分子标记技术检测ω-secalin 基因和GIu-1 位点，明确甘肃省小麦1BL/1RS易位系的分布利用和HMW-GS组成情况，建立小麦种质资源信息平台，以期为甘肃小麦品质改良提供信息和理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
小麦1BL/1RS 易位系检测供试材料552 份，包括国内外引进品种100 份，冬小麦育成品种110份、新品系107份，春小麦育成品种80份、新品系155份，以我国20世纪70年代从罗马尼亚引进的1BL/1RS易位系代表品种洛夫林13为阳性对照。从中选出小麦育种亲本材料、大面积推广品种及新品种（系）等400份进行HMW-GS组成研究，以已知亚基组成的中国春（Null、7+8、2+12）、中优9507（1、7+9、5+10）、陇鉴338（Null、14+15、2+12）为对照。上述供试材料来自甘肃省东西部小麦种植区近年来引进和选育的冬、春小麦品种（系），具有较好的代表性，分别由甘肃省农业科学院小麦研究所、旱地农业研究所、植物保护研究所、生物技术研究所及天水市农业科学研究所、定西市农业科学研究院等小麦育种部门提供。
1.2 试验方法
1.2.1 小麦基因组DNA提取
选取少量种子用小块干净布包起来用钳子夹碎，再用研钵研成粉末或直接用锤砸成粉末，将大约100 mg的面粉转移到1.5 mL的离心管中，DNA提取采用改良CTAB法进行。采用琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度后，稀释终浓度至100 ng/uL，-20 ℃保存备用。
1.2.2 引物序列及合成
1BL/1RS 易位系检测利用1RS 位点上黑麦碱ω-secalin 基因的STS 标记（Sec-P1/Sec-P2）和1BS 位点上编码LMW 优质亚基Glu-B3 标记（Glu-B3F/Glu-B3R）。HMW-GS 检测与面筋强度密切相关的Ax1/Ax2*（Glu-A1 位点）、Bx14 和Bx7OE（Glu-B1 位点）及Dx5（Glu-D1 位点）优质亚基，其中Glu-A1 位点通常编码3 种亚基，即Ax1、Ax2*和AxNull，通过鉴定AxNull 可以间接反应Ax1/Ax2*亚基的有无。引物序列及其预期扩增片段大小见表1。以上引物由北京invitrogen生物技术有限公司合成。
表1 检测基因引物序列及其扩增片段大小
Table 1 Primer sequences and amplification fragment sizes of the targeted genes
1.2.3 PCR反应和电泳条件
本研究供试材料群体较大，拟采用多重PCR 对6个与小麦加工品质性状相关的基因进行检测，以降低试验成本，提高效率。多重PCR反应体系参照梁强等的方法，主要从引物用量、退火温度、延伸时间和循环数等方面对体系进行调试优化，均衡PCR产物量，通过增大扩增量少的引物用量，减小扩增量多的引物用量（表1），筛选出退火温度接近、扩增产物分子量差别较大的不同标记组建多重PCR，以对照材料进行验证。PCR 反应体系为20 μL，模板DNA 用量100 ng，2×Taq PCR MasterMix（中科瑞泰北京生物科技有限公司）10 μL，引物用量随扩增产物量的多少进行调整。PCR 反应在BIO-RAD T100TM型扩增仪中进行，反应程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，退火40 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃延伸10min。PCR 产物采用1.5%～1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为1×TAE，120 V 电泳40 min。结束后用溴化乙锭染色，凝胶成像系统（BIO-RAD Gel DocTM XR+）观察照相。
1.2.4 品质性状测定
选取冬小麦育成品种中的1BL/1RS 易位与非1BL/1RS 易位品种，测定粗蛋白、赖氨酸、湿面筋、沉降值等品质指标。小麦籽粒用瑞典Tecator 公司的1093 型Sample mill 实验磨磨粉，过1 mm 的筛片备用。籽粒粗蛋白含量采用德国布朗-卢比公司IA-450 型近红外分析仪按国标GB5511—1985 测定；湿面筋含量测定按照国标GB/T14608—93 采用手工洗涤法；赖氨酸含量测定采用茚三酮显色法；沉淀值测定按照国标GB/T15685—1995 采用SDS法。
1.2.5 统计分析
采用SPSS16.0数据统计分析软件进行差异显著性比较。
2 结果与分析
2.1 甘肃小麦种质资源1BL/1RS易位系分子检测
应用小黑麦ω-secalin 基因特异标记Sec-P 与小麦LMW-GS 的Glu-B3 位点，采用多重PCR 技术检测1BL/1RS 易位系，部分育种亲本材料检测结果见图1。从电泳图谱可看出，1BL/1RS 阳性对照洛夫林13 可扩增出一条1076 bp 的特异条带，亲本材料永3002、陇鉴9811、石4185、陇春23、西旱3号、蒙优1号等扩增片段大小与对照相同，表明这些材料为1BL/1RS 易位系；非1BL/1RS 易位品种可扩增出一条630 bp 的目标条带，如津强6 号、永1265、宁春4号、垦红19、格来尼、罗布林等。本研究建立的Sec-P与Glu-B3复合PCR产物互补出现，可以相互验证，而且能鉴定该位点的杂合情况。552 份供试材料中检测出1BL/1RS 易位系202 份（包括杂合体45 份），占36.6%，非1BL/1RS 易位系350 份，占73.4%。在不同类型的小麦资源中1BL/1RS 易位系分布比例差别较大，其中在冬麦育成品种、引进品种中的比例较高，分别为51.8%和41%（表2）。
图1 部分甘肃小麦育种亲本材料Sec-P与Glu-B3位点多重PCR检测结果
Fig.1 Multiplex PCR specific for tested locus Sec-P and Glu-B3 in partial Gansu wheat breeding parents materials
M：DNA Marker Ⅴ；1: 洛夫林13；2：津强6 号；3：永1265；4：永3002；5：永T28；6：陇鉴9811；7：石4185；8：陇春23；9：宁春4 号；10：垦红19；11：格来尼；12:罗布林；13：辽春10 号；14：西旱3 号；15：武春3 号；16：武春5 号；17：武春8 号；18：2014；19：4035；20: 大赖草后代；21：蒙优1号；22：蒙鉴7号；23：新春2号；24：甘春20号
表2 不同类型小麦品种（系）中1BL/1RS易位系和HMW-GS优质亚基分布
Table 3 Distribution of 1BL/1RS translocation lines and HMW-GS gene in different type of wheat introduced，improvered varieties and new lines.(https://www.daowen.com)
2.2 甘肃小麦种质资源HMW-GS分子检测
2.2.1 AxNull与Dx5位点分子检测结果
由AxNull 与Dx5 基因特异标记建立的复合PCR 体系，在Glu-A1 位点，携带AxNull 基因的材料可扩增出920 bp 的DNA 片段；在Glu-D1 位点，含Dx5 基因可扩增出450 bp 的目标条带，该体系扩增条带清晰，重复性好，部分育种亲本材料检测结果见图2。从图中可以看出，陇春23、银麦8号、临麦32等扩增出与中国春相同的目标条带，表明这些材料携带AxNull 基因，在Glu-A1 位点不编码合成谷蛋白亚基。张春11 号、张春16 号、蒙花2号、中8131、永良15 号等品种只扩增出450 bp 的特异条带，证明Glu-D1 位点含Dx5 基因，可编码5+10优质亚基，而且Glu-A1位点可编码优质亚基Ax1/Ax2*。同时能扩增出两条带的兰优5706、陇春23、平凉40，说明Glu-D1 位点编码5+10 优质亚基，但Glu-A1 位点不能编码合成Ax1/Ax2*亚基。对400 份供试材料检测结果表明，其中210 份材料有Dx5基因，占52.5%；135份材料检测到AxNull基因，占33.8%。
图2 部分甘肃小麦育种亲本材料AxNull与Dx5位点多重PCR扩增结果
Fig.2 Multiplex PCR specific for tested locus AxNull and Dx5 in partial Gansu wheat breeding parents materials
M:DNA MarkerⅡ；1:中优9507；2：张春11 号；3：张春16 号；4：甘春21 号；5：巴08Q123；6：巴08Q8；7：蒙花2 号；8：巴08Q12；9：兰优5076；10：中8131；11：陇春19 号；12:陇春23 号；13：陇春29号；14：陇春30号；15：中国春；16：宁春35；17：宁春39；18：宁春41；19：青春37；20:银春8号；21：临麦32；22：宁麦9号；23：永良15号；24：平凉40。
2.2.2 Bx7OE与Bx14多重PCR检测结果
小麦B组染色体Glu-B1位点编码的Bx7OE与Bx14亚基可明显提高面筋强度，是已被公认的优质亚基。本研究利用Bx7OE与Bx14亚基特异PCR标记，对400份供试材料进行检测，发现只有野猫、格莱尼、津强5 号和津强6 号4 个引进品种可扩增出844 bp 特异条带，表明Glu-B1位点携带Bx7OE基因，检出率仅为1%，在本地品种中没有检测到Bx7超量表达基因。陇鉴338已知具有14+15亚基，Bx14亚基特异PCR 产物可扩增出1256 bp的目标条带，部分小麦高代品系Bx14 位点检测结果见图3。图中泳道7、10-15、20、21 的DNA 片段大小与对照陇鉴338 相同，证明这些品系含有Bx14 位点。在所有供试材料中检测出54 份含有Bx14基因，占总数的13.5%。
图3 部分甘肃小麦高代品系Bx14位点PCR检测结果
Fig.3 PCR specific for tested locus Bx14 in partial Gansu spring wheat advanced lines
M：DNA MarkerⅡ；1：陇鉴338；2～24：春小麦新品系
2.3 甘肃小麦品种（系）1BL/1RS易位系和HMW-GS优质亚基分布
试验数据统计结果表明，在不同类型小麦品种（系）中1BL/1RS 易位系和HMW-GS优质亚基的分布存在明显差异（表2）。在552 份供试材料中，检测出1BL/1RS 易位系202份，占总数的36.6%，其中在引进品种及冬、春小麦品种（系）中分别有41、88 和73 份，所占比例各自为41%、40.6%、31.1%。110份冬麦育成品种中57份为易位系，所占比例高达51.8%。对小麦HMW-GS优质亚基的研究结果表明，在400份供试材料中，Glu-A1位点有135 份材料检测到AxNull 基因，占33.8%，由此可推断出编码Ax1/Ax2*优质亚基所占比例为66.2%，尤其在春小麦新品系中分布比例高达76.1%。Glu-D1 位点检测出含Dx5 基因的材料210份，占总数的52.5%，其中引进品种中Dx5所占比例最高，达到74.5%，在冬麦和春麦高代品系中分别为54.2%和56.8%，但在育成品种中的比例却很低，分别为18.5%和44.8%。Glu-B1 位点含Bx7OE与Bx14 基因的材料分别有4 份和54 份，检出率分别为1%和13.5%，Bx14 基因在冬小麦新品系中分布较多，占新品系的27.9%。从整体来看，1BL/1RS易位系在冬麦育成品种中分布比例最高，在新品系中分布比例趋于降低；与早期研究结果相比，HMW-GS 优质亚基Ax1/Ax2*、Dx5 和Bx14 出现频率总体呈现上升趋势，优质强筋亚基Bx7OE检出率仅为1%，且全为引进品种，在本地品种（系）中未检出该亚基类型。
2.4 1BL/1RS易位与非1BL/1RS易位品种品质比较
冬小麦育成品种中，1BL/1RS 易位系比例高达51.8%，远大于其他品种类型。取冬小麦1BL/1RS易位与非1BL/1RS易位品种各15个，对二者蛋白质、赖氨酸、湿面筋含量、沉降值等品质参数进行了显著性检测（表3）。结果表明，冬小麦育成品种中非1BL/1RS易位小麦与1BL/1RS易位小麦其蛋白质含量、赖氨酸含量、湿面筋含量的参数差异不显著，容重和沉降值的参数差异达到显著水平（P＜0.05）。据研究，在预测面筋强度方面沉淀值明显优于湿面筋含量，由此可见，非1BL/1RS易位品种的面筋强度优于1BL/1RS易位品种。
表3 1BL/1RS易位与非1BL/1RS易位品种品质比较
Table 3 Comparison of quality parameters between 1BL/1RS and Non-1BL/1RS wheat
注：平均值后的不同字母表示差异达5%显著水平。
2.5 亲本相似的1BL/1RS易位品种与非1BL/1RS易位品种品质比较
平凉42 是非1BL/1RS 易位品种，平凉43 是1BL/1RS 易位品种，二者的亲本材料非常接近（表4），在遗传背景相似的前提下，对二者蛋白质、赖氨酸、湿面筋含量、沉降值等品质指标进行了显著性检测。结果表明，小麦平凉42 与平凉43 的千粒重、容重、蛋白质含量、赖氨酸含量参数差异不显著，湿面筋含量和SDS 沉淀值参数差异达到显著水平（P＜0.05）。从综合检测指标来看，1BL/1RS 易位品种平凉43 的品质甚至优于非易位品种平凉42，可能的原因是平凉43 为1BL/1RS 易位杂合体，其Glu-B3 位点能正常合成LMWGS，而且Glu-D1位点能够合成5+10优质亚基。在遗传背景相似的情况下，该研究结果证明了Glu-B3 位点的正常表达及5+10 优质亚基对1RS 易位导致的品质负面影响起到了一定的补偿作用。
表4 亲本相似的1BL/1RS易位品种与非1BL/1RS易位品种品质比较
Table 4 Comparison of quality parameters between 1BL/1RS and Non-1BL/1RS wheat with the similar Parents
3 结论
采用STS 分子标记技术，检测了小黑麦ω-secalin 基因与小麦LMW-GS 的Glu-B3 位点及Glu-1 复合位点上有重要育种价值的优质亚基类型。明确了甘肃小麦种质资源中1BL/1RS易位系分布频率为36.6%，Glu-1位点优质亚基Ax1/Ax2*、Dx5分布比例近年来有所提高，但Glu-B1 上HMW-GS 优质亚基种类和频率低。建议在小麦品质改良中应减少1BL/1RS易位系出现的频率，加强对具有Ax1/Ax2*、Bx7OE、Dx5、Bx14等优质亚基核心亲本的引进和利用。
参考文献（略）
王红梅，厚毅清，欧巧明，石有太：甘肃省农业科学院生物技术研究所
陈玉梁：甘肃省农业科学院黄羊试验站