转基因小麦抗旱性鉴定及相关指标灰色关联度分析[6]
全球40%的耕地面积位于干旱区，干旱是影响农业生产的最重要非生物胁迫因子。中国小麦主产区集中在干旱半干旱地区，近年来干旱灾害天气频发，对我国小麦生产造成巨大损失的严重形势下，发掘、利用抗旱节水基因资源进行改良小麦品种的抗旱性尤为重要。分子生物学和基因工程的迅猛发展为利用转基因技术培育抗旱小麦新品种提供了一条有效途径。
研究表明，植物中bZIP 类转录因子参与干旱、盐渍等逆境胁迫在内的广泛的生物学反应。中国农业科学院生物技术研究所赵军研究小组利用酵母单杂交的方法克隆到一个可与Cat1 基因上游顺式作用元件ABRE2相互作用的bZIP类转录因子ABP9。ABP9参与ABA信号传导及ROS 代谢调节。在转ABP9基因的拟南芥、高羊茅、苜蓿、大豆、水稻等植物中的研究表明，该基因可以显著提高植株对干旱、盐渍、低温抗旱等逆境的耐受性。同时，利用基因枪法将ABP9 基因导入西北春麦区的主栽品种宁春4 号小麦中，获得了稳定的宁春4 号转基因系列纯系材料，经前期的抗逆性鉴定，ABP9 基因显著地提高了转基因小麦的抗旱性。
本试验以转ABP9 基因春小麦纯系材料及受体品种宁春4 号为研究对象，在雨养和灌溉两种栽培条件下，对这些材料的主要农艺性状和生化性状进行测定，采用隶属函数法进行抗旱性鉴定和综合评价，同时利用灰色关联度分析法对相关抗旱性状进行评价，以期为抗旱转基因小麦新品种的选育和鉴定提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料为9 个转基因株系，UC4-1、UC4-2、UC4-3、UC4-4、UC4-5、UC4-6、UC4-7、UC4-8、UC4-9，以及野生型对照宁春4号、非转基因春小麦品种定西35号。
1.2 试验方法
2011 年3 月将上述材料种植在甘肃省农业科学院小麦转基因隔离试验区，2 行区，行长1.8 m，每行均匀点播189 粒，行距0.20 m，随机区组设计，3 次重复。将其分设为旱地试验和水地试验。水地试验于拔节期、分蘖期、灌浆期各灌溉1 次，共3 次；灌水每次750 m3·hm-2（约为75 mm 的降雨量），三次总计2 250 m3·hm-2。旱地试验全生育期完全依靠自然降水。甘肃兰州地区2011 年在春小麦生育期3—7 月降水量约为117 mm，属于较为干旱的年份。测定生化指标时，于小麦抽穗期时取其叶片，用湿纱布擦干净后用液氮冷冻，带回实验室置于低温冰箱中，测定相关指标时取出。丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸方法；脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定参照Chander 的方法，过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法；在对农艺性状进行考种时，于小麦完熟后每份材料每个重复分别取10株测定株高、穗长、穗粒数、千粒重、单穗粒重、分蘖数、结实小穗数等7项指标。
1.3 数据分析
对所测定的生理生化和农艺性状等共计11 项指标，参照相关文献，利用如下公式计算抗旱系数、综合抗旱系数、抗旱指数、隶属函数值、抗旱性量度（D）值；并根据灰色系统理论，对各指标的抗旱系数按照公式（6）进行无量纲化处理，按照公式（7）（8）计算关联系数和关联度。
式中，Xs和Xr分别为干旱胁迫和对照下各材料各指标的测定值，-Xs为该指标在干旱胁迫下的平均值；PIimin、PIimax为各性状抗旱系数的最小值和最大值；ri为各性状抗旱系数与综合抗旱指数的相关系数；X′i（k）为数据无量纲处理后的结果、Xi（k）为各材料各指标的抗旱系数、
和Si分别为同一指标的平均值和标准差；ρ 为分辨系数，取值为0～1，本研究中取值0.5。所有的计算均采用Excel 2003和SPSS 19.0 软件进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 转ABP9基因春小麦纯系材料的各指标隶属函数值及抗旱性评价
作物的抗旱性是环境胁迫与基因型相互作用的结果，通过不同时期生理、生化及农艺性状等指标发生一系列变化而体现出来。本研究对转ABP9 基因小麦在雨养和灌溉两种栽培条件下的7 项农艺性状指标（株高、穗长、结实小穗数、千粒重、单穗粒重、有效分蘖、穗粒数）和4 项生化指标（MDA 含量、SOD 活性、POD 活性、脯氨酸含量）进行了测定（表1 和表2），并利用公式（1）计算出所测定的抗旱系数，通过相关分析计算各性状与综合抗旱系数（抗旱系数的平均值）的相关系数，继而利用公式（5）计算出各材料的隶属函数值。参照王刚、冷益丰、南炳东等直接用平均隶属函数值进行转基因植物抗旱性综合评价的方法，本研究的结果表明（表3），在供试的9 份转ABP9 基因小麦中，6 份材料的平均隶属函数值均高于其受体亲本宁春4 号，占参试材料的66.67%，以UC4-8 的表现最为突出，超过宁春4 号40.80% ，其次分别为UC4-2、UC4-6、UC4-4、UC4-9、UC4-1；而且4 份转基因小麦UC4-8、UC4-2、UC4-6、UC4-4 的平均隶属函数值超过西北春麦区旱地区域试验的非转基因对照品种定西35。
由公式（3）所计算的抗旱性量度（D）值，在多种植物的抗旱性综合评价中得到了广泛应用，许多研究者采用D 值对植物的抗旱性进行综合评价，取得了较为理想的结果。本研究对参试的9 份转ABP9 基因小麦的11 项抗旱相关指标计算D 值见表4。结果表明，6份转基因小麦的D 值超过受体亲本对照，依次分别为UC4-8、UC4-6、UC4-1、UC4-9、UC4-2、UC4-4，其中3 份材料的D 值超过西北春麦区旱地区域试验的非转基因对照品种定西35；UC4-8的表现依然突出，其D 值为0.5768，排名第一，超过受体亲本对照宁春4号39.90%。
由平均隶属函数值和抗旱性量度D值分别对转基因小麦材料进行抗旱性综合评价的结果大体相同，如UC4-8 在两种评价方法中均排名第一；转基因小麦UC4-1、UC4-2、UC4-4、UC4-6、UC4-8、UC4-9 的抗旱性均超过亲本对照。但也稍有差异，如UC4-2在用平均隶属函数值时其综合抗旱性排名第二，而用D值评价时则只位列第六；UC4-4在前者中的排名为第四，超过非转基因对照品种宁春4号，而在后者中的排名为第七，低于宁春4号3个名次。
2.2 灰色关联度分析
根据灰色系统理论，关联度反映的是构成该系统的各性状组成的比较数列和参考数列间的密切程度，关联度越大，说明该数列和参考数列间的关系越密切。本研究中，按灰色系统理论要求，将测定的7 项农艺性状指标和4 项生理生化指标的抗旱系数纳入一个灰色系统，各个性状视为该系统的一个灰因素，以产量抗旱指数为参考数列，通过公式（6）对各供试材料所测定的11项性状的抗旱系数数据进行无量纲化处理，再利用公式（7）和（8）分别计算关联系数和关联度，同时对各性状的关联度进行了排序（表5）。由表5可以看出，株高（PH）与产量抗旱指数的关联度最大，为0.6817，其余依次为单穗粒重（SW）、穗长（SL）、SOD 活性（SA）、穗粒数（NKS）、结实小穗数（SNE）、有效分蘖数（ET）、POD活性（PA）、千粒重（TKW）、脯氨酸含量（PC）、MDA含量（MC）。
表1转基因小麦在雨养条件下（干旱胁迫）的生化指标及农艺性状
Table 1 Biochemical and agronomic traits in transgenic wheat under rain-fed environment（drought stress）
注：PH，株高；SL，穗长；NS，结实小穗数；TKW，千粒重；SW，单穗粒重；ET，有效分蘖；NKS，穗粒数；MC，MDA 含量；SA，SOD 活性；PA，POD活性；PC，脯氨酸含量；下表同。
Note: PH，Plant height；SL，Spike length；SNE，Spikelet numbers per ear；TKW，1000-kernal weight；SW，Single spike weight；ET，Effective tillers；NKS，Number of kernel per spike；MC，MDA content；SA，SOD activity；PA，POD activity；PC，Proline content；The same as in the following table.
表2转基因小麦在灌溉条件下的生化指标及农艺性状
Table 2 Biochemical and agronomic traits in transgenic wheat under well-watered environment(https://www.daowen.com)
表3转基因小麦农艺性状和生化指标的隶属函数值及抗旱性综合评价
Table 3 Subordinate function values of agronomic traits and biochemical indexes in different transgenic wheat lines as well as comprehensive evaluation of drought resistance in these materials
表4转基因小麦的D值及抗旱性综合评价
Table 4 D value of transgenic wheat lines and comprehensive evaluation of drought resistance in these materials
表5 转基因小麦主要农艺性状和生化指标与抗旱指数的关联度和关联序
Table 5 Correlation degrees and correlation order of agronomic traits，biochemical indexes and drought-resistance indexes in transgenic wheat lines
3 讨论
作物的抗旱性是复杂的数量遗传性状，通过一系列生理生化和形态变化表现出来，具有单项研究的局限性和综合研究的复杂性。多年来，在作物的抗旱性鉴定指标的选择和评价方法上，国内外学者做了大量研究工作，提出了多种抗旱性鉴定指标与评价方法。从抗旱性鉴定指标来看，主要有形态指标、农艺性状指标和生理生化指标，不同的指标与作物抗旱性之间的关系，研究结果并不一致；在评价方法上，大多数研究者认为，由于抗旱性是多种因素综合作用的结果，采用多指标的综合评价比单指标评价更为科学和客观。利用模糊数学的隶属函数分析法得到的抗旱性度量D值，既考虑各指标的相互关系，又考虑其重要性，能消除单个指标的片面性，因而可以较准确地评价各材料的抗旱性。
基于上述原因，本研究对用基因枪法转化西北春麦区主栽品种宁春4 号所获得的9 份转ABP9 基因春小麦，测定了7 项农艺性状和4 项生化指标，通过计算各材料各性状的抗旱系数，利用相关分析法，获得了每份小麦材料的平均隶属函数值和抗旱性量度D值，参照不同研究者以平均隶属函数值以及用抗旱性量度D值的方法进行抗旱性综合评价，结果表明，两种评价方法所获得的结果大体相同，6 份转基因小麦UC4-1、UC4-2、UC4-4、UC4-6、UC4-8、UC4-9 的抗旱性均较受体亲本宁春4 号增强，其中以UC4-8 的表现最突出；但也有所差异，如UC4-2 和UC4-6 的抗旱性排名差异稍大（表4、表5）。由公式（5）可以看出，抗旱性度量D值与隶属函数值密切相关，但同时考虑了各性状指标的权重及各指标与综合抗旱系数之间的相关系数，由于不同的性状指标对作物抗旱性的贡献并非相同，因此用抗旱性度量D值对抗旱性进行综合评价应该更为准确。
灰色系统理论中的关联度分析是对动态系统进行量化比较的分析方法，系统中因素之间的关联度大，说明其变化态势接近，相互关系密切，反之，其相互关系疏远。利用灰色关联度分析法对各性状指标和抗旱性之间的关系进行评价，近年来在各种作物的抗旱性研究中也多有应用。关联序（关联度排名）结果显示（表5），排名前7位的指标依次分别为株高、单穗粒重、穗长、SOD 活性、穗粒数、结实小穗数、有效分蘖数，可以看出，除SOD 活性外，其余均为农艺性状指标，与王士强等的研究结果有较大差异，这可能与ABP9基因的作用有关。前期的研究表明，ABP9基因在转基因拟南芥中的组成型表达能够降低细胞内活性氧（ROS）水平，降低氧化损伤和细胞死亡，提高大量参与清除和调控活性氧的胁迫应答基因的表达，这样就使得在干旱胁迫环境下，植物体内参与调控活性氧的一些抗氧化酶及相关化学物质含量维持在较低的水平；至于ABP9 在转基因小麦中的确切机制，还需要进一步研究。当然，由于抗旱性研究的复杂性，也不能排除供试材料的基因型、生长环境及取材时期等因素对研究结果的影响。
参考文献（略）
罗影：甘肃农业大学资源与环境学院
赵军：中国农业科学院生物技术研究所/国家作物基因资源和基因改良重大科学工程
王剑虹：兰州职业技术学院生物工程系
裴怀弟，叶春雷，李进京，欧巧明，王红梅，王炜：
甘肃省农业科学院生物技术研究所
张斌科：甘肃农业大学农学院
【注释】
[1]本论文在《作物杂志》2010年第4期已发表。
[2]本论文在《麦类作物学报》2012年第32卷第2期已发表。
[3]本论文在《草业学报》2014年第23卷第3期已发表。
[4]本论文在《中国农业科学》2014年第47卷第19期已发表。
[5]本论文在《干旱地区农业研究》2015年第33卷第5期已发表。
[6]本论文在《干旱地区农业研究》2015年第33卷第1期已发表。