西和半夏凝集素抗虫基因克隆及对棉花的遗传转化[1]
据统计，全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%，直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。同翅目害虫蚜虫、稻飞虱和叶蝉等对农业生产造成的危害是严重的，在直接引起作物的产量损失和品质下降的同时，还将多种致病病原菌和病毒传播给植物，加重危害程度。在植物抗虫育种研究中，应用植物外源凝集素基因转基因技术获得抗虫特性近年来研究较多。在体外或转基因抗虫试验中应用最多的是雪花莲外源凝集素（GNA），研究结果显示对烟草夜蛾、豌豆象、飞虱和蚜虫等咀嚼式和刺吸式口器昆虫均有抗性。
半夏（Pinellia ternata）为天南星科半夏属植物。凝集素是半夏蛋白的重要组分之一，能专一结合甘露糖，属于单子叶植物甘露糖凝集素家族（孙册等，1983；王克夷等，1993）。研究结果显示，人工饲喂半夏凝集素提取物的量达到1.2 g/L 时，对棉蚜发育有明显的抑制作用；当人工饲喂半夏凝集素提取物的量达到1.5 g/L时，对桃蚜发育有明显的抑制作用（黄大昉等，1997）。
国内部分实验室应用半夏凝集素基因（pta）在水稻（张红宇等，2003）及百合（唐东芹等，2004）、菘蓝（许铁峰等，2003）等植物上开展了转基因研究，获得了一些转基因工程植株，显示出良好的抗虫性能和应用前景。
甘肃西和半夏是半夏之精品，在国内外享有盛誉。本研究克隆了甘肃西和半夏凝集素完整基因，通过花粉管通道法开展了棉花转基因研究，旨在建立棉花转基因方法和培育抗虫种质。
1 材料与方法
1.1 试验材料和试剂
本试验用西和半夏无菌苗、大肠杆菌（E.coli）DH5α、植物表达载体pBI121 由本实验室保存。Taq DNA Polymerase、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶购自大连宝生物公司，Rnase、GEM-T vector、DNA 回收试剂盒等分别购自Sigma 公司、Promega 公司和中科开瑞生物公司。参照Genbank 半夏凝集素基因（AY191305.1）的核心序列，以及XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点，设计了PCR扩增正、反向特异引物。引物由大连宝生物公司合成。以甘肃省棉花主栽品种陇棉2号（代号k9505，白棉）为试验材料。
1.2 半夏凝集素基因pta的扩增
按照CTAB 法（王关林等，1998）提取半夏模板DNA 进行PCR 扩增和产物回收，方法见参考文献（张正英等，2010）。
1.3 扩增产物的克隆及鉴定
依照说明将扩增的PCR 产物克隆到T-easy 载体上，转化大肠杆菌DH5α。通过蓝白斑筛选、重组质粒限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物的电泳结果进行鉴定。
1.4 序列测定与分析
阳性克隆送大连宝生物公司测序。测序结果用BLAST和DNAMAN 6.0软件分析。
1.5 植物表达载体的构建
按照张正英等（2010）叙述方法进行载体构建。
1.6 花粉管通道法介导的棉花遗传转化
参照《分子克隆》实验指南提取待转化质粒。参照刘方等介绍方法（刘方等，2008）进行转化，方法略有修改。先沿纵轴插入至子房中轴约2/3 处，然后再退至约1/3处开始注射。涂抹赤霉素溶液（浓度40 mg/kg）于处理铃柄基部，以减轻幼铃脱落。同时，对转基因铃绑线以区分非转基因处理棉铃。质粒浓度10～20 μg/mL，每朵花注射用量10 U。
1.7 导入材料的田间筛选和室内分析
将收获的处理棉花种子种植于大田。利用4000～5000 mg/L 的卡那霉素在T1棉花苗期、盛蕾期喷涂倒2叶，选出抗性植株，单独收获。将T2棉铃种子按单粒种植，待长出第一片真叶时进行2500 mg/L 的卡那霉素溶液涂抹，每天分早、中、晚3 次涂抹，连续7 d。统计棉花叶片的变化情况。表现为抗性的材料进一步进行4000 mg/L、6000 mg/L 的卡那霉素抗性检测。对检测到的抗性植株做PCR检测。
2 讨论
在早先的试验中，证明所克隆的半夏凝集素基因具有较好的抑制蚜虫效果，转基因烟草植株的蚜口密度抑制率在25.5%～89.4%，平均蚜口密度抑制率为56.2% （张正英等，2010）。本研究通过花粉管通道法将半夏凝集素基因直接转入棉花品种陇棉2 号中，通过抗性筛选和PCR 分析证明获得了转基因后代。对T1抗性植株在伏蚜期田间调查单株蚜量，以棉株顶部5 叶中受害最重叶片为标准叶，结果初步显示抗性植株对棉蚜表现中抗水平，抗性植株蚜害减退率较对照高10%。抗虫性是否稳定表达，需要继续验证。
花粉管通道法操作简单，转化成本较低，为农作物育种提供了创造新种质的新途径。多数利用花粉管通道法获得转化棉花后代的研究报告，提供了分子生物学证据（翁坚等，1984；郭三堆等，1999；邓德旺等，1999）。但是，转化后代假阳性植株多，鉴定工作量大，总体转化效率低（周小云等，2008）。
本研究从6000 mg/L卡那霉素抗性植株中检测出了报告基因nptⅡ，而非抗性植株没有扩增出nptⅡ基因，说明6 000 mg/L 卡那霉素的筛选是可靠的。但这个浓度比刘方等（2008）建议的要高，与马纪等（2008）的相同。
在经卡那霉素抗性筛选的PCR 分子鉴定中，没有扩增到pta，可能与马盾等（2007）报道的外源基因丢失和外源DNA的遗传不稳定有关。(https://www.daowen.com)
本研究中选用了4 种不同的受体材料，所做处理数相同，但只有陇棉2 号得到的转化植株，这是否说明花粉管通道法的成功与否也与基因型依赖有关，仍需要做进一步的试验分析。
3 结果与分析
3.1 半夏凝集素基因pta扩增
扩增模板DNA 为提取纯化的半夏叶片基因组DNA，特异引物为pta-F、pta-R，通过PCR扩增获得目的基因片段长度约1 000 bp，长度与试验设计预期结果一致（图1）。
图1 PCR扩增半夏DNA片段
Fig.1 DNA fragment of Pinellia ternate amplified by PCR
M：100 bp DNA marker；1，2：PCR产物
M:100 bp DNA marker；1，2:PCR product
3.2 目的基因的克隆与鉴定
按照回收试剂盒说明，纯化回收PCR扩增产物，将其连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌DH5α。少量提取重组质粒用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切及PCR 进行鉴定（图2），结果都出现了大约1 000 bp 的序列片段，其长度与扩增片段相符。证明pGEM-T 载体构建是正确的（图2）。
图2 pGEM-T-pta重组质粒PCR及酶切鉴定
Fig.2 Identification of pGEM-T-pta by PCR and Enzymetic Digestion
M：DL2000 DNA marker；1，2，3：PCR扩增产物；4：阴性对照；5，6：XbaⅠ和SmaⅠ双酶切产物
M: DL2000 DNA marker；1，2，3: PCR Dproduct；4: Negative control；5，6: Digesting products by XbaⅠ，SmaⅠ
3.3 半夏凝集素基因pta序列及其编码氨基酸分析
pta 序列测定结果表明（图3），扩增片段全长为1069 bp，应用DNAMAN 6.0 对序列进行分析，在序列的29～835 nt处发现一连续ORF，第29～31 nt处是该序列的转录起始密码子ATG，833～835 nt为终止密码子，全编码区为804 bp，编码一条268个氨基酸残基的多肽，预测分子量29.1 kD，等电点为7.77。5′端非编码区（5′UTR）28 bp，3′端非编码区（3′UTR）234 bp。在poly（A）上游存在典型的真核生物基因poly（A）的信号序列-AATAAA。第27～120位氨基酸残基、第144～177位氨基酸残基分别为两个保守结构域，第1个结构域含1个甘露糖结合位点，第2个结构域含2个甘露糖结合位点，具有甘露糖结合植物凝集素的典型特征（Lin et al，2006）；分析pta 编码蛋白N-末端序列，发现序列中N-端有21 个氨基酸残基的信号肽，剪切位点位于第24 位的丙氨酸（A24）和第25 位的缬氨酸（V25）之间；前端33 个氨基酸和中间区域第118～155 位的37 个氨基酸残基主要是由一些疏水性氨基酸组成的肽链，其余区域以亲水性氨基酸组成，从整体来看，pta 在一级结构上以亲水性为主。pta 已在GenBank/EMBL 中登记，登录号：AY725425。与已报道的同科PTA 基因核苷酸序列比对分析显示，该基因序列也有相似的保守序列域和QXDXNXVXY （QDNVY）甘露糖结合识别区，因而推测也应具有相同的抗虫功能。
图3 表达载体pBI-pta结构简图
Fig.3 The scheme of plasmid pBI-pta
3.4 表达载体pta的构建与鉴定
用XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶对质粒pGEM-pta进行酶切，回收1069 bp的目标片段。用XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶消化pBI121质粒后，补平经SmaⅠ黏端，然后将回收的pta基因通过黏端（XbaⅠ）-黏端（XbaⅠ）、平端（SmaⅠ）-平端（SmaⅠ）连接，得到由CaMV 35S 启动子驱动的pta 基因的植物表达载体pBI-pta （图3），导入E.coli DH5a。进行酶切和PCR，均得到一条1069 bp 目标片段，说明pBI-pta 植物表达载体的构建是正确的，可以用于基因转化研究。
3.5 转基因棉花植株及其后代的抗性筛选和分子鉴定
以陇棉2号为受体材料，做2000个导入处理，收获T0棉铃共130个，导入材料成铃率为6.5%。将T0棉铃种子按单粒种植，经卡那霉素筛选获得T1抗性植株5株，单株收获并进行室内考种。抗性植株与对照田间调查和室内考种发现，两者在植株形态与经济性状上无明显差别。
用2500 mg/L卡那霉素连续涂抹棉花第一片真叶7 d后，对照及导入材料仅有个别植株（＜5%）有叶片变薄、变大和发黄症状；4000 mg/L 卡那霉素涂抹5～7 d后，有50%以上植株叶片明显黄化或出现黄色斑点；6000 mg/L 卡那霉素涂抹3～6 d 后，50%～96%植株黄化。在后续转基因棉花的筛选中直接选用了6000 mg/L 卡那霉素作为筛选浓度，筛选周期为6 d，每批转基因材料筛选周期缩短约14 d，T2植株中，23株卡那霉素6000 mg/L 的黄化植株PCR 扩增没有出现pta 和nptⅡ目的条带；14 株抗性植株中有6 株扩增出现了nptⅡ的目的条带（图4），但都没有扩增出pta基因。PCR分子鉴定结果初步表明，外源nptⅡ已整合到棉花的基因组中。
图4 棉花抗性植株nptⅡ扩增结果
Fig.4 npt Ⅱamplification of cotton resistant plants
M：DL2000 DNA marker；1～15：抗性植株；-：未转基因对照；+：阳性对照
M:DL2000 DNA marker；1～15:Transgenic plant；-:Nontransgenic plant；+:Positive control
张正英：甘肃省农业科学院
李淑洁，李静雯，王红梅：甘肃省农业科学院生物技术研究所