外源基因整合的Southern杂交鉴定

印迹（Blot）通常是指通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的大分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些大分子物质的过程。Southern 杂交技术以经过标记的DNA 或RNA 探针，与靶DNA 进行特异性杂交，分析外源基因在植物染色体上的整合情况（如拷贝数、插入方式）以及外源基因在转基因后代的稳定性问题。杂交可在液相及固相中进行。现在实验室中广泛采用的是在固相膜上进行的固-液杂交。Southern 杂交的实验包括以下几个主要步骤：植物基因组DNA 的提取；探针的制备；基因组DNA 的限制性酶切，凝胶电泳分离酶切片段并通过毛细转移、电转移或真空转印法转移至尼龙膜或硝酸纤维素膜；探针与转移至膜上的酶切DNA 杂交；杂交信号的检出（放射自显影或根据标记物的特有性质检出）。(https://www.daowen.com)

随着Southern 杂交技术的不断成熟，其越来越多地被应用到农作物基因工程基础研究和转基因育种中。夏志辉等利用双右边界T-DNA 载体系统将广谱抗白叶枯病基因Xa21转入水稻恢复系明86。通过Southern 杂交，获得了该转基因系特异的杂交指纹图谱，证实该基因完整插入到水稻染色体内，在后续继代过程中无片段丢失，且内部无缺失。刘会云、王婉晴等采用Southern 及染色体原位杂交（FISH）对在Glu-B1 位点上1Bx20 和1By20 双亚基沉默的小麦无性系变异体AS208 进行研究证实，6 条染色体出现杂交信号，染色体原位杂交（FISH）结果显示其比对照轮选987 中出现杂交信号的染色体少2 条。杨静等采用农杆菌介导转化法，将反义GmFAD2-1B 基因导入栽培大豆品种，获得油酸含量显著提高的转基因大豆新品系。Southern 杂交检测表明，外源GmFAD2-1B 基因片段已导入大豆基因组，其插入拷贝数为1～5 个。qRT-PCR 检测表明，外源GmFAD2-1B 主要在大豆种子中表达，并导致种子中内源GmFAD2-1 mRNA 表达水平显著降低。总之Southern杂交技术在水稻、小麦、大豆等主要农作物遗传转化研究中的应用，可为农作物转基因研究方法的明确及转基因食品安全检测方法的探索提供参考。