甜瓜APX和Mlo基因的克隆与功能分析

甜瓜是重要的瓜类作物，在世界范围内广泛栽培。近年来，甜瓜白粉病逐渐成为栽培中的主要病害，在露地以及保护地生产条件下，发病后均可导致严重减产，品质下降。常见病原菌主要为瓜单丝壳属白粉菌和二孢白粉菌，瓜单丝壳白粉菌的危害性要大于二孢白粉菌。生产上主要通过常规杂交选育的方法，培育甜瓜抗白粉病品种，但是由于白粉病原菌生理小种的演替速度很快，所以抗病育种往往落后于小种更替。施用化学杀菌剂是目前防控白粉病的主要手段，但又往往损伤了叶片和带来了污染。因此，通过基因工程，创造广谱抗白粉病的甜瓜种质具有重要的意义。

本研究从甜瓜中克隆到APX 和Mlo 家族基因，研究了各基因在白粉病胁迫条件的表达，发现APX 和CmMlo 家族基因在白粉病发病过程中具有一定的相关性，其中CmMlo2在白粉病发病过程中具有重要作用，可能参与了白粉病抗性机制的负调控过程，缺失Mlo 会降低白粉病入侵的门槛。将CmMlo2构建RNA 干扰载体，转化甜瓜，获得了抗白粉病的To代转基因植株，试验取得的主要结果如下：

（1）利用同源序列设计兼并引物，通过RT-PCR 方法从甜瓜叶片中克隆到抗坏血酸过氧化物酶APX 基因的中间片段，再通过5′-RACE 和3′-RACE 分别克隆得到5′端片段和3′端片段，拼接后设计特异引物扩增到全长1012 bp cDNA，ORF 为750 bp，编码249 个氨基酸的多肽，分子量大约为27.3 kDa。同源序列比对表明，甜瓜APX 基因和黄瓜、番茄、玉米、小麦、大麦、拟南芥等APX 基因高度同源，将该基因命名为CmAPX，GenBank 登录号：EF693949。根据获得的cDNA 序列，设计引物，从基因组扩增得到甜瓜APX 的gDNA序列，与cDNA 序列比对发现，CmAPX 包含10个外显子、9个内含子，所有内含子均符合GT-AG剪切规则。

（2）构建了pET24-CmAPX 原核表达载体，诱导1、2、3、4、5 h 后蛋白表达量分别占总融合蛋白的40%、47.5%、50.6%、51.7%、51.6%。表明CmAPX 基因在pET24a（+）载体中获得高效表达。表达产物具有APX 酶活性，说明CmAPX 编码抗坏血酸过氧化物酶基因。

（3）通过RT-PCR 半定量，甜瓜APX 基因在不同器官中呈非特异性表达，在叶片中的mRNA 含量明显高于根、茎、花及果实。经白粉病诱导0、1、3、5、7 d 后，表达量在5 d 时达到最高值，和叶片中酶活性变化一致，表明CmAPX 可能参与了白粉病生物胁迫过程。(https://www.daowen.com)

（4）根据大麦、拟南芥等Mlo 基因的保守序列，设计兼并引物，扩增得到了3 个甜瓜Mlo 类似中间片段，进一步通过Race 技术，获得了3 个cDNA 全长，分别命名为CmMlo1、CmMlo2和CmMlo3。其中CmMlo1全长1551 bp，编码516个氨基酸；CmMlo2全长1713bp，编码570个氨基酸；CmMlo3全长1464 bp，编码487个氨基酸。序列比对结果表明，CmMlo属于基因家族，和拟南芥的Mlo 基因同源性在70%左右。定量和半定量分析结果表明，Cm-Mlo在甜瓜组织中呈特异性表达，在受到白粉病胁迫条件下，CmMlo2表达量上调，CmMlo2可能参与了白粉病发病的负调控过程。

（5）跨膜蛋白预测表明，CmMlo2为跨膜蛋白，具有7 个跨膜螺旋结构，构建pROKCmMlo2-GFP 融合蛋白并转化洋葱表皮细胞，结果表明，CmMlo2蛋白定位于细胞膜，将pROK-CmMlo2-GFP 融合蛋白转化烟草，野生型烟草出现了荧光，构建发夹结构pFGC1008-CmMlo2干扰载体，转入荧光烟草可以导致荧光消失，表明干扰载体对靶序列是有效的。

（6）建立了稳定高效的甜瓜再生体系，优化了甜瓜遗传转化体系，通过农杆菌介导法转化感白粉病甜瓜材料，获得了转化植株。PCR 结果及荧光定量分析表明，pFGC1008-CmMlo2己经整合到甜瓜基因组，接种白粉病鉴定表明，转化植株具有白粉病抗性，叶片表面未见白粉病菌丝生长。转化植株卷须早，长势较对照（野生型植株）弱，叶片大小、色泽没有明显区别，RNAi植株没有出现明显的生理缺陷。

程鸿：甘肃省农业科学院蔬菜研究所