花粉管通道法导入高粱DNA引起小麦抗条锈性遗传变异及其机理分析
在探索合理利用抗病基因策略的同时，寻找和研究高品位抗条锈基因和种质资源，并培育持久抗病品种已成为研究的焦点。而从有关栽培或野生的异种属中去寻找抗病基因，通过外源抗病基因的导入创造抗病新种质，间接或直接提高栽培小麦抗病水平就显得格外重要。花粉管通道法遗传转化等分子育种技术为拓宽小麦抗性基因资源和品质改良提供了新的途径。已有的研究结果表明，花粉管通道法介导的遗传转化及其后代能产生变异，已相继在40 多种作物上取得了显著成效；在国外SCI/EI 期刊也相继出现报道，并已获得大量优良小麦新品种。
为了能持续获得优良小麦抗锈种质材料，拓宽小麦抗条锈基因资源，本研究拟采用花粉管通道法，将抗逆性强、对条锈病免疫的C4作物高粱（Sorghum bicolor）基因组DNA 导入重度感病的稳定品系89122，并通过苗期和成株期抗条锈鉴定加以验证分析，以期引入高粱抗条锈基因，突出抗条锈目标性状的遗传改良，创造优良抗条锈新品种，为小麦抗条锈分子育种及相关研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 外源DNA供体材料
高粱：禾本科高粱属，一年生草本，体细胞染色体数目2n=20，生育期130 d，分蘖旺盛，抗逆性强，适应性广。由甘肃省农科院生物技术研究所引种。
1.1.2 受体材料
89122：甘肃省春小麦品种，2n=42，株高90 cm，叶宽，旗叶下披，穗长约10 cm，红粒，籽粒粉质，分蘖成穗率中等，耐盐碱，高感条锈病，品质较差。由甘肃省农科院生物技术研究所采用花粉管通道法育成的粉质春小麦品种。
1.2 试验方法
1.2.1 供体总DNA的提取
采用CTAB 法，按照刘学春等报道的方法，提取供体高粱基因组DNA，紫外分光光度计检测，A260/A230=2.13＞2.00，A260/A280=1.87＞1.80；琼脂糖电泳呈单一区带，无拖尾现象，表明所提纯的DNA分子量在50 kb以上，蛋白质等杂质已去除干净，达到作物DNA导入所要求的纯度。基因组DNA 溶于1×SSC 溶液，4 ℃冰箱储存，导入前用蒸馏水稀释至300 μg·mL-1。
1.2.2 供体高粱基因组DNA的导入
供体高粱基因组DNA的花粉管通道法导入参考倪建福等的方法。
1.2.3 导入后代的处理及选择
待导入穗幼胚形成后，记作D0代种子。取其15～20 d 胚龄的幼胚进行幼胚培养，于MS 培养基上直接诱导幼胚成苗（D1），并于温室加代选择，所获D1代种子进行田间点播。D2代点播于单株选择圃，选择各种变异株，按单株收取种子；自D3代起播种于株系选择圃，连续选择优良株系，直至获得稳定的变异株系和有价值的育种材料。D4～D6代依次参加高代产量比较试验、品系鉴定试验和品种比较试验，逐代筛选优良品系。自D1代起进行观察、记载和统计分析。
1.2.4 抗条锈性鉴定(https://www.daowen.com)
自D1代起，连续进行对供体、受体及后代变异株采用新叶涂抹法进行混合菌条锈菌孢子粉田间人工接种，成株期进行条锈病鉴定。自D6代委托省级作物抗病性鉴定机构（甘肃省农业科学院植物保护研究所）进行混合菌和新强毒菌株分生理小种的苗期和成株期条锈病鉴定。条锈病记载及分级标准采用国家质量技术监督局1995 年颁布的《小麦条锈病测报调查规范》国家标准。
2 结果与分析
2.1 抗条锈病鉴定
2.1.1 田间人工接种混合菌条锈菌的成株期条锈病鉴定
经连续田间成株期人工接种条锈菌混合菌鉴定，结果显示，外源DNA 导入新品系2001502-23 连续8 年对条锈病表现免疫；而外源DNA 供体高粱经鉴定对条锈病免疫，导入受体89122则自1998年起逐渐对条锈病丧失抗性（表1），其条锈病反应型从1998年的2型增加至4型（高感条锈病）。
表1 2002—2008年外源DNA供体、导入受体与后代新品系的条锈病抗性鉴定与比较
注：记载标准采用0～4级分类法，记载项目：反应型/严重度/普遍率。
2.1.2 分生理小种的苗期和成株期条锈病鉴定
自D6代委托省级作物抗病性鉴定机构（甘肃省农业科学院植物保护研究所）进行混合菌和新强毒菌株分生理小种的苗期和成株期条锈病鉴定，结果显示：外源DNA 导入新品系2001502-23苗期对混合菌，成株期对水4、水7、水14、HY8、条中32和混合菌均表现免疫；而外源DNA供体高粱经鉴定对条锈病免疫，导入受体89122的苗期对混合菌和成株期分生理小种鉴定均表现高感条锈病（反应型4 型）。上述结果证明，采用花粉管通道法将外源高粱DNA导入感条锈病春小麦89122后，实现了小麦抗条锈性状的恢复和高粱抗条锈基因向普通小麦的转移或小麦抗条锈基因的变异（见表1）。
3 结论
本研究将高粱基因组DNA导入高感条锈病的稳定小麦品系，获得1个稳定优良变异新品系，经连续的成株期混合菌人工接种鉴定，以及苗期、成株期混合菌和分生理小种条锈菌委托鉴定，对条锈病免疫，而供体高粱也对条锈病免疫，推测高粱抗条锈基因可能已经转移进入小麦基因组，从而实现了小麦抗条锈性遗传改良。这种相同的异源供体基因组DNA 导入不同小麦材料产生了相同的变异情况，其可能的原因是异源高粱基因组DNA 的导入对受体基因组中抗条锈基因的转化机理和变异效果相同所致。
异源高粱基因组DNA 导入受体小麦后的新品系的条锈病抗性变异机理，正如万文举等（1992）报道，外源DNA 导入具有双重作用，直接遗传转化和生物诱变均是外源DNA导入可能的遗传转化机理之一，是一种综合作用的结果。
参考文献（略）
欧巧明，崔文娟，王炜，罗俊杰：甘肃省农业科学院生物技术研究所