半夏凝集素基因的克隆及转基因烟草对蚜虫的抑制作用[3]
摘要：采用同源序列克隆方法，通过设计特异性引物从甘肃西和半夏叶片基因组DNA中克隆到1 条1069 bp 的半夏凝集素基因pta，与以同科内植物的mRNA 为模板扩增得到的凝集素基因序列的同源性很高，达到98%以上，功能区完整，具有1 条信号肽和3 个甘露糖结合区，GenBank 登录号AY725425。用该基因替换pBI121 载体的GUS 基因，正向插入35S启动子之下，构建了植物表达载体pBI-pta。通过农杆菌介导法转化烟草，从20株Kan抗性植株中得到PCR 检测阳性植株14株，证明pta已整合到烟草基因组中。对随机挑取的7株PCR 阳性植株进行了抗蚜虫（Myzus persicae）筛选试验，结果表明，不同株系蚜口密度抑制率为22.5%～89.4%，平均蚜口密度抑制率为56.2%。
凝集素（1ectin）是一类可逆的结合特异单糖或寡糖的蛋白质，不同的凝集素分子具有特定的氨基酸组分，而且凝集素的糖结合位点也各不相同。对凝集素的研究近年来发展迅速，尤其在植物基因工程中，植物外源凝集素基因的抗虫特性越来越受到重视。关于凝集素的杀虫机理，一般认为外源凝集素进入昆虫消化道后，与肠道围食膜细胞表面的糖蛋白结合，降低膜的通透性，从而影响营养物质的正常吸收。此外，这种结合还可能在昆虫的消化道内诱发病灶，引起消化道内细菌和病毒的繁殖等，从而对昆虫本身造成危害。目前研究较多且成功应用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有雪花莲凝集素（GNA）基因、豌豆凝集素（P-Lec）基因、麦胚凝集素（WGA）基因和半夏凝集素（PTA）基因。其中，雪花莲外源凝集素在体外或转基因抗虫试验中，已证实对某些咀嚼式和刺吸式口器昆虫均有抗性，如烟草夜蛾、豌豆象、飞虱和蚜虫，但对高等动物没有毒性。
半夏系天南星科半夏属植物，是中国传统的中草药。从掌叶半夏和半夏中提取的凝集素对麦管蚜、棉蚜、桃蚜等有致死作用。当人工饲喂量分别达到1.2 g/L和1.5 g/L时，棉蚜和桃蚜受到明显抑制，是一种有重要应用价值的抗虫资源。国内已有少数实验室正在进行pta的分离克隆，并在水稻、百合、菘蓝等植物上开展了转化，得到了一些工程植株。
蚜虫是危害最严重的世界性农业害虫之一，广泛危害农作物和园艺作物，除取食引起的直接损失外，还传播近100种植物病毒，从而造成作物的更大损失。因此，培育抗蚜虫的作物品种在生产上具有重要意义。抗虫基因工程育种技术克服了常规抗虫育种方法周期长，无法利用远源及异源抗性基因，无法进行多种异源基因同时导入等问题，为抗虫育种提供了一种新途径。
通过克隆甘肃西和半夏凝集素基因、构建植物表达载体pBI-pta，用农杆菌介导法转入烟草中，并对PCR检测阳性植株进行了抗蚜虫能力鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
甘肃省西和县在历史上是中国半夏之乡，2008年获国家“地理标志产品”认证，所产半夏粒大，色白，药用效果好，是半夏中的精品。本试验用西和半夏无菌苗、大肠杆菌DH 5a、农杆菌LBA4404、植物表达载体pBI121、烟草品种（Nicotiana tabacum var.）NC89均为甘肃省农科院生物技术研究所遗传工程实验室保存。GEM-T vector 购自Promega有限公司，各种限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、Tag DNA Poly-merase 均购自大连宝生物公司；RNase 购自Sigma 公司；DNA 回收试剂盒购自中科开瑞生物公司；其他化学试剂购自国内生物试剂公司，均为分析纯。
根据GenBank 中半夏凝集素基因（gi:37779708）核心序列设计PCR 扩增特异引物，引物中的下划线分别表示酶切位点Xba I和Sma I。
引物由大连宝生物公司合成，PEF：5′-CAGTCTA-GACCAGCAGCAACCCGGCTC-3′，PER：5′-CAGGGGCCCACCTATGGCTACGAAGGC-3′。
1.2 方法
1.2.1 半夏凝集素基因的扩增
以按照CTAB 法提取的西和半夏无菌苗叶片基因组DNA 为模板，PEF、PER 为引物，按如下条件进行PCR 扩增反应：94 ℃预变性4 min；94 ℃40 s、58 ℃40 s、72 ℃1.5 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃结束反应。PCR 扩增产物的检测、回收、连接、转化及PCR、酶切鉴定和测序均按常规方法操作。
1.2.2 半夏凝集素基因植物表达载体的构建
用限制性内切酶Xba I 和Sma I 分别对测序结果正确的半夏凝集素基因和植物表达载体pBI121进行双酶切，回收基因片段。按如下体系进行连接：T4 DNA 连接酶（5 U/μL）10μL，反应缓冲液25 μL，回收的基因片段75 μL，回收的载体片段140 μL，加灭菌水至250 μL。16 ℃连接反应过夜。将构建正确的植物表达载体对大肠杆菌进行转化，并进行PCR 和酶切鉴定，最终获得由CaMV35S 启动子驱动pta，新霉素磷酸转移合成酶（nptII）基因作为筛选标记基因的植物表达载体pBI-pta。
1.2.3 农杆菌介导的烟草转化及转基因烟草的分子鉴定
采用农杆菌介导法转化烟草叶盘，在愈伤组织培养、分化培养和生根培养阶段用不同浓度抗生素进行选择，对试验获得的20株卡那霉素阳性植株进行PCR鉴定。
1.2.4 转基因烟草植株抗蚜虫试验
转pta 的PCR 阳性烟草植株移栽后，待株高20 cm 左右时，随机选取7 株作为试验材料，每株人工接种2～3 龄桃蚜（Myzus persicae）10 头，套上防蚜网罩，以未转基因植株为对照，之后每5 d统计1次，连续统计6次。
蚜口密度抑制率效果评价参照文献。蚜口密度抑制率= （对照植株虫数-参试植株虫数）/对照植株虫数×100%；平均蚜口密度抑制率=各个株系的蚜虫密度抑制率之和/参试株系数×100%。
2 结果与分析
2.1 半夏凝集素基因（pta）扩增
以半夏叶片基因组DNA 为模板，用合成的特异引物PEF、PER 进行PCR 扩增pta，得到一约1000 bp 特异片段，其大小与预期片段大小相符。将扩增片段回收后，克隆到pGEM-T 载体。对重组质粒用Xba I 和Sma I 双酶切及PCR 进行检测（图1），结果都出现一约1000 bp特异片段，说明所扩增的特异片段已正确插入pGEM-T载体上。
图1 pGEM-T-pta重组质粒PCR及酶切鉴定
M:DNA Marker DL2000；1，2，3:PCR产物；4:阴性对照；5，6:Xba I和Sma I双酶切
2.2 半夏凝集素基因（pta）序列及其编码的蛋白分析
测序结果表明，扩增得到pta 序列为1069 bp，利用DNAMAN 6.0 对pta 序列进行分析，发现该基因无内含子，与已知pta 序列［gi：37779708］同源性为98.04%。全编码区为804 bp，编码268 个氨基酸序列。对所推测的氨基酸序列进行分析表明，该蛋白分子量为29.1 ku，等电点为7.77，前段33 个氨基酸主要是由一些疏水氨基酸组成的肽链，N-端有21 个氨基酸残基的信号肽，剪切位点位于第24 位的丙氨酸（A24）和第25 位的缬氨酸（V25）之间，3个保守序列QXDXNXVXY （QDNVY）的甘露糖结合识别区。
综上所述，所克隆半夏凝集素基因与同科植物凝集素具有相同的保守区域和甘露糖结合区，因而也应具有相同的功能。(https://www.daowen.com)
2.3 植物表达载体pBI-pta的构建和鉴定
用限制性内切酶Xba I和Sma I酶切质粒pGEM-pta，回收1069 bp的目的片段。pBI121质粒经Xba I 和Sst I 限制性内切酶消化后，先用预先设计的接头序列补平经Sst I酶切消化后的黏端，然后将回收的pta 通过黏端（Xba I）-黏端（Xba I）、平端（Sst I）-平端（Sma I）连接，得到由CaMV35S 启动子驱动pta 的植物表达载体pBI-pta （图2），导入E.coli DH5a。进行酶切（图3）和PCR （图4）鉴定，均得到1 条1069 bp 目标条带，与预期结果一致，表明pBI-pta表达载体构建正确，该载体以CaMV 35S为启动子，新霉素磷酸转移合成酶npt II基因作为筛选标记基因。
图2 表达载体pBI-pta构建示意图
图3 pBI-pta重组质粒双酶切鉴定
M:DNA Marker DL2000；1:阴性对照；2，3，4:Xba I和Sma I双酶切
图4 pBI-pta重组质粒PCR鉴定
M:DNA Marker DL2000；1:水；2，3，4:重组质粒
2.4 烟草转化体系的建立和优化
将烟草无菌苗叶圆盘浸入浓度为0.5～0.8 的农杆菌LBA4404 （含重组质粒pBI-pta）菌液中，感染8～10 min 后，取出在无菌吸水纸上略为吸干，放在共培养基（MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L）上28 ℃黑暗培养3～4 d，转入加有适当浓度Kan和Cb的愈伤组织诱导培养基（MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+Kan 150 mg/L+Cb 500 mg/L）上进行培养。每隔两周转接一次。当愈伤长到一定程度后，转到加有抗生素的分化培养基（MS+6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.05 mg/L + Kan 150 mg/L + Cb 500 mg/L）上分化出苗。将分化出来的苗剪下，移至生根培养基（1/2 MS+Kan 100 mg/L+Cb 200 mg/L）中进行生根培养。将生根植株分单株扩繁，一部分用于提取DNA进行分子检测，另一部分准备移栽。
2.5 转基因烟草的PCR检测
以卡那霉素阳性植株的叶片为材料，小量提取基因组DNA 为模板，以pta 特异引物进行PCR扩增，扩增得到的DNA片段与阳性对照相同，约为1069 bp，阴性对照（野生型烟草）没有该扩增产物。20 个烟草转基因Kan 抗性株系经PCR 鉴定，14 株为阳性株系，转化率为87% （转化率=PCR 阳性植株数/接种的外植体数×100%）。阳性烟草植株PCR 分子鉴定结果初步表明，外源pta已整合到烟草的基因组中（图5）。
图5 部分转pta烟草PCR检测
M:DL 2000 Marker；+:阳性对照；CK:阴性对照；1～6:转pta烟草
2.6 转基因烟草对蚜虫生长的抑制作用
随机挑取7 株PCR 阳性植株和非转基因植株（CK）进行了抑制蚜虫生长试验，结果表明半夏凝集素对蚜虫有较强的抑制作用。如图6、图7 所示，转基因植株的蚜口密度抑制率在25.5%～89.4%，平均蚜口密度抑制率为56.2%。单株之间有差异，5 号和7 号株系抑虫效果较好，分别达到77.4%和89.4%，6号株系表现较差，仅为25.5%，这可能与PTA蛋白的表达量有关。PTA蛋白含量的分析检测工作正在进行之中。
图6 接种后20 d 转基因烟草不同株系对蚜虫的抑制率
图7 转基因烟草不同株系上蚜口密度
3 讨论
在本研究中转基因植株的蚜口密度抑制率平均为56.2%，略高于Hinder 等报道的转GNA基因烟草对桃蚜的平均抑制率50%；高于梁辉等报道的8个转GNA基因小麦植株抗蚜抑制率47%，王关林等报道的转GNA 基因菊花平均蚜口密度抑制率39.4%，和周岩等报道的转GNA 基因烟草对桃蚜的抑制率45%～60%；低于袁正强等转经过遗传改造后的GNA基因烟草的平均蚜口密度抑制率71.0%。雪花莲凝集素（GNA）基因是植物转基因研究应用较多的一类凝集素，从本研究结果看，半夏凝集素具有和雪花莲凝集素同样的抗虫效果，可以应用到抗虫基因工程育种中。近年来已有转半夏凝集素基因的研究显示，其具有很好的抗虫特性。转半夏凝集素基因烟草植株对蚜虫产生了有效抗性，但并不能杀死或完全抑制蚜虫，这与半夏凝集素的抗虫机理有关，即外源凝集素进入昆虫消化道后，与肠道围食膜细胞表面的糖蛋白结合，降低膜的通透性，影响营养物质的正常吸收而导致昆虫死亡，起到了间接杀虫作用。这一研究结果与已经报道的雪花莲凝集素、麦胚凝集素等植物凝集素的抗虫特性一致。因此，通过对抗虫试验的分析可以认为，本研究中克隆的PTA基因和构建的植物表达载体是成功的，该基因和载体可用于植物抗虫育种研究。
在烟草抗蚜虫试验中，接种后25 d为蚜虫数量消长的转折点，25 d以前转化株系和对照植株的蚜虫数量都在持续上升，但转化株系的蚜虫数量明显低于对照，25 d之后对照植株的蚜虫数量还在继续增加，而转化植株的蚜虫数量迅速下降（数据未列出）。通过对这一现象的分析认为，组成型启动子CaMV 35S驱动pta不断持续表达，当表达量积累到一定程度时，pta 的抗虫效果就得到了充分表现。因此，从基因表达的长效机制来分析，如果从烟草的整个生育期来考察pta的抗虫特性，也许效果会更显著。
Hinder 等认为，GNA 蛋白的含量只要达到蛋白总量的0.1%以上就可以使植株对蚜虫具有明显的抗性。本试验检测了7株转基因烟草植株的抑制蚜虫效果，蚜口密度抑制率为25.5%～89.4%，单株之间有很大差异，这可能与PTA 蛋白的表达量不同有关。因此，改造半夏凝集素基因和表达载体、扩大转基因群体仍能够继续提高抑制蚜虫的效果。
参考文献（略）
张正英：甘肃省农业科学院科研处、甘肃省农业科学院生物技术研究所
令利军，王红梅，李淑洁，李静雯：甘肃省农业科学院生物技术研究所