半夏凝集素基因对油菜的遗传转化及REAL-TIME PCR 分析[1]

半夏凝集素基因对油菜的遗传转化及REAL-TIME PCR 分析 ^[1]

半夏凝集素是一种新的抗虫资源，研究表明，其粗提液对刺吸式同翅目害虫具有明显的抗虫性，对麦管蚜、棉蚜和桃蚜等有致死作用，是一种有重要应用价值的抗虫基因。目前已得到了转pta 基因的水稻、烟草、百合和苜蓿，pta 基因对油菜的遗传转化还未见报道。

SYBR GREEN I REAL-TIME PCR 能通过熔解曲线有效区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，是基因鉴定检测的新方法。本研究以半夏凝集素基因为目的基因，采用农杆菌介导法转化油菜，并用实时荧光定量PCR 方法对转基因油菜中的外源基因（半夏凝集素基因，pta）和内参基因（油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，pep）进行分析，优化了实时荧光定量PCR反应条件和反应体系，为采用SYBR Green I荧光染料法进行转基因油菜中外源基因的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 油菜材料及其预培养

供试材料为甘蓝型油菜（Brassica napus）陇油2 号种子（由甘肃省农业科学院作物研究所提供）。选取籽粒饱满、大小均匀的油菜种子，用70%乙醇消毒1 min，15%NaClO溶液消毒6 min，0.1%HgCl2溶液消毒5 min，无菌水冲洗3遍，接种于MS培养基。取3～4 d苗龄的无菌苗子叶为转化受体材料，接种到预培养基YY上（成分见表1），25 ℃暗培养2～3 d。

表1　油菜组织培养及农杆菌转化培养基列表

1.1.2 农杆菌菌株和载体

用于本研究的pBIpta-1/LBA4404为甘肃省农业科学院生物技术研究所保存，重组质粒结构见图1。

图1　pBIpta-1/LBA4404质粒结构图

1.1.3 引物序列

试验中所用引物均由Invitrogen 公司合成。ptaF、ptaR 为外源基因pta 的扩增引物，pep prime-upper、pep prime-lower 为内参基因pep 的扩增引物，选pta 基因全长序列中高度保守区域中145 bp 的pta2为荧光定量PCR 扩增的目的片段，pta2 prime-upper、pta2 primelower为pta2的扩增引物。pat、pep、pta2引物序列见表2。

表2　pta、pep、pta2引物序列

1.2 方法

1.2.1 农杆菌介导的油菜遗传转化及转基因植株的常规PCR检测

①AgNO3在子叶愈伤组织分化中的作用。取预培养2～3 d 的油菜子叶转接到YR1、YR2、YR1+5 mg/L AgNO3和YR2+5 mg/L AgNO34种愈伤组织分化培养基上，分别统计绿苗分化率，研究AgNO3在油菜子叶愈伤组织分化中的作用。

②含目的基因的农杆菌菌液的制备及对油菜的感染。农杆菌经平板培养、小量培养、大量培养逐级激活，OD600值为0.5～0.8 时，5000 r/min 离心10 min，收集菌体，用等体积MS液体培养基重悬，最后使OD600值约等于0.5。将预培养2～3 d的油菜子叶在上述准备好的菌液中感染3～5 min，然后转移到共培养基（附加200 μmol/L的乙酰丁香酮，其他同表1中分化培养基YR1）暗培养3 d。

③愈伤组织分化、植株再生和抗性植株筛选。共培养结束后将材料转入附加有500 mg/L羧苄西林的分化培养基YR1上，采用25 ℃，16 h 光照（光照强度约为1600 lx）培养。当分化苗长至1～2 cm 时，转接至附加有18 mg/L 卡那霉素和400 mg/L 羧苄西林的壮苗培养基（见表1）进行培养。培养约7 d出现白化或叶片变紫的非抗性苗。将抗性苗转接到含200 mg/L羧苄西林根培养基上继续培养生根。

④卡那霉素抗性植株的常规PCR 检测。采用CTAB 法提取油菜抗性植株的基因组DNA，以表2 中pta-F、pta-R 为特异引物进行pta 基因的PCR 扩增。PCR 反应程序为：94 ℃预变性，4 min；94 ℃，1 min；58 ℃，45 s；72 ℃，1 min 20 s，30 cycle；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。扩增片段长度为1069 bp，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 常规PCR阳性植株的REAL-TIME PCR 分析

以油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（pep）作为油菜的内参基因，以未转基因油菜为对照，水为空白对照，进行pta2目的片段的REAL-TIME PCR 分析。

①转基因植株中pep基因、pta2片段的REAL-TIME PCR 分析。pep基因扩增的反应条件为94 ℃，5 min；94 ℃，20 s；56 ℃，30 s；72 ℃，40 s；84 ℃，5 s；plateread，40个循环。pta2片段扩增的反应条件为94 ℃，5 min；94 ℃，15 s；58 ℃，15 s；72 ℃，20 s；84 ℃，5 s；plateread，40个循环。转基因植株、未转基因植株对照、空白对照同时进行扩增，均设3个平行。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

②熔解曲线分析。pep 基因、pta2 片段熔点曲线的测定均是从65 ℃到90 ℃，每隔0.2℃/2 s 测定吸光值1 次。数据由Opticon MonitorTM3 软件采集、分析。愈伤组织分化率和转化率计算公式：愈伤组织分化率= （分化的愈伤组织数目/接种的愈伤组织数目）×100%转化率= （转化植株数目/接种的外植体数目）×100%

2 结果与分析

2.1 影响油菜遗传转化的因素及转基因植株的常规PCR检测

2.1.1 AgNO3在愈伤组织分化中的作用

AgNO3作为乙烯抑制剂，是油菜组织培养中常用的添加剂，可以促进外植体分化，防止其褐化，从而较大幅度地提高油菜再生频率及再生芽数。从试验结果看，添加5 mg/L AgNO3后，外植体的褐化现象大大降低，其再生频率比对照（未加AgNO3）提高了约27% （表3）。这与王景雪和石淑稳等报道的油菜下胚轴、子叶再生培养时，向分化培养基中加入定量的AgNO3有利于大幅度地提高不定芽分化率的结论一致。

表3　AgNO3对愈伤组织分化率的影响(https://www.daowen.com)

2.1.2 预培养时间对遗传转化的影响

外植体在用农杆菌感染前，一般要经过一段时间的预培养，以刺激外植体细胞进行脱分化细胞分裂，而处于分裂状态的细胞更容易整合外源DNA 使转化率提高。在农杆菌感染油菜子叶之前，用含1.0 mg/L 2,4-D 和0.2 mg/L 6-BA 的预培养基对外植体进行一定时间的预培养可以提高转化率；而未经预培养阶段直接用农杆菌感染，材料褐化十分严重且大量死亡，在筛选培养中几乎得不到绿芽。预培养时间过短（1 d），外植体材料对培养基不适应，细弱，感染后会产生较严重的褐化和死亡现象。预培养时间超过4 d，外植体创伤处会呈现疏松状，且切面创伤逐渐愈合致使农杆菌难以侵染，从而使再生频率降低。试验表明，对子叶进行3 d农杆菌感染前预培养可得到较高的转化率，达到3.3% （表4）。

表4　预培养时间对转化效率的影响

2.1.3 农杆菌菌液浓度×感染时间对转化的影响

适宜的农杆菌感染浓度和感染时间是影响遗传转化成功与否的重要因素。试验采用3种农杆菌菌液浓度×感染时间的组合，分别统计绿苗分化率和转化率，以研究农杆菌菌液浓度×感染时间组合因素对油菜遗传转化效率的影响。试验结果（表5）表明，采用OD600值为0.5，感染5 min可获得较高的转化率（3.3%）。

表5　菌液浓度×感染时间对油菜遗传转化的影响

2.1.4 卡那霉素抗性植株的PCR检测

以5 株卡那霉素抗性植株的基因组DNA 模板进行pta 基因的PCR 检测，结果有3 株扩增出了与阳性对照（载体质粒）相同大小的目的片段，而阴性对照（转基因植株）和空白对照（水）未出现扩增（见图2）。由此初步证明，半夏凝集素基因已整合到油菜的基因组中。

图2　转基因油菜植株的PCR检测

1，3，4：转基因阳性植株；2，5：阴性植株；6：阳性对照；7：阴性对照；8：空白对照；M：DNA Marker DL2000

2.2 PCR阳性植株的REAL-TIME PCR 分析

从图3、图4 的扩增曲线可以看出，转基因植株及未转基因对照都扩增出了121 bp 的pep 基因，而只有转基因植株才扩增出了145 bp 外源的pta2片段。这两个基因的熔解曲线都是单峰型，说明在PCR 扩增过程中，没有出现非特异性扩增，由此推断定量PCR 扩增所获得的数据是可靠的。荧光定量RCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果（图5、图6）也证明转基因植株中内参基因和外源基因的扩增为特异性扩增。

图3　样本中pep基因的扩增曲线

1，3，4：转基因植株；2：未转基因对照；5：空白对照

图4　样本中pta2基因的扩增曲线

1，2，3：转基因植株；4：未转基因对照

图5　转基因油菜pep基因PCR检测

1，2，3：转基因植株；4：未转基因对照；M：DNA Marker I

图6　转基因油菜pta2基因PCR检测

1，2，3：转基因植株；4：未转基因对照；M：DNA Marker I

3 结论与讨论

本试验选用甘肃省油菜主栽品种陇油2号无菌苗子叶作为研究材料，建立了针对陇油2 号的稳定的再生体系，适宜的预培养培养基为MS+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L，分化培养基为MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 2.5 mg/L+AgNO35 mg/L。试验结果表明，在预培养阶段采用2,4-D 与低浓度的6-BA 配合可使外植体处于最佳的生理和转化状态。与王景雪等、石淑稳等认为2,4-D 对诱导愈伤组织是必需的，2,4-D 配合6-BA 诱导愈伤组织的绿苗分化率明显提高的结论相吻合。在愈伤组织分化阶段，分化培养基添加5 mg/L的AgNO3后，外植体的褐化现象显著减轻，分化率平均提高了约27%，这与唐桂香等报道的AgNO3可明显增加甘蓝型油菜子叶外植体的芽再生频率，提早形成芽的结论一致。在油菜遗传转化中，AgNO3的使用浓度在不同的报道中差异很大，但都取得了较好的效果，这可能是AgNO3和油菜基因型之间存在互作效应以及培养材料的生理状态不同所致。

根据本试验结果，优化了农杆菌介导的油菜遗传转化体系，确定预培养3 d 农杆菌菌液OD600值为0.5，感染5 min 获得较高的转化率（3.3%）；建立了针对陇油2 号的稳定的遗传转化体系，为开展该品种的基因改良奠定了基础。油菜的遗传转化率不同的基因型有较大差异，本试验的遗传转化率不高，可能与所选材料的基因型有关。

参考文献（略）

李淑洁，王红梅，张正英：甘肃省农业科学院生物技术研究