马铃薯转GhABF2转录因子苗期耐盐性研究[5]
土壤盐渍化是农作物生长中经常遇到的逆境条件之一，也是严重制约农业生产发展的重要因素。因此，如何提高植物的抗盐性、增加盐胁迫下作物的产量一直是人们关注的焦点。马铃薯（Solanum tuberosum）是世界上广为种植的粮菜兼用型作物，属弱耐盐性作物，对水分亏缺和盐非常敏感，盐害不利于其生长，对产量影响极大，目前生产上广泛种植的品种的耐盐性均不是很高，因此选育马铃薯优良品种，提高马铃薯产量、质量以及抗逆性，受到人们的高度重视。在培育马铃薯品种的研究中，利用基因工程技术有较大的优势，因其可以通过块茎无性繁殖，将转基因特性传递给后代而无需经花培纯化或多代选育。但是通过基因工程提高作物抗盐性方面的工作进展缓慢，主要是因为抗盐的机制没有完全搞清楚，目前还不能确定是哪些基因或者哪些代谢过程在植物的抗盐性中起关键作用。因此，首先要进行的是植物抗盐生理生化的研究，搞清盐害和抗盐机制，以期提出和找到提高植物抗盐能力的有效措施，并且为培育转基因抗盐作物奠定基础。
转录因子又称反式作用因子，是一组通过与顺式作用元件特异结合调控基因表达的蛋白质，在调控植物应答非生物胁迫的过程中起着非常重要的作用。中国农科院生物技术研究所郭三堆成功克隆了棉花中AREBs家族基因，主要调控干旱胁迫，并获得了GhABF2上下游基因的序列信息，构建了GhABF2抗逆基因植物表达载体，有研究表明在拟南芥、烟草上进行了转化，可以显著提高作物的抗逆性。本研究以甘肃省特色作物马铃薯为研究对象，以期通过转录因子GhABF2参与植物响应外界环境胁迫的转录调控研究，筛选和创制出一批优良加工专用性的马铃薯抗旱种质，提升甘肃马铃薯抗旱新品种的选育水平，降低因干旱造成的损失，对马铃薯产业的可持续发展具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验在甘肃省农业科学院生物技术研究所实验室进行，供试材料为转GhABF2转录因子马铃薯两个株系材料（用T1 和T2 表示，在表型上没有显著的差异；用WT 表示未转基因材料），采用NaCl胁迫处理方式。
1.2 处理方式
1.2.1 NaCl盐胁迫处理
NaCl用MS生根培养基分别配制成浓度为0、40、80和160 mmol/L的固体培养基，经高压蒸汽灭菌后待用。将生长了30～40 d的转GhABF2基因马铃薯植株和对照未转基因马铃薯植株放在超净工作台上，取中间生长较为一致的茎段，剪成1芽1段，接入提前配制好的盐胁迫培养基上，造成盐胁迫，每瓶10芽，每处理6瓶。处理试管苗放在25 ℃、16 h/8 h昼/夜光周期下培养，以正常未转基因试管苗为对照。处理后25 d，进行相关指标的测定，重复3次。
1.2.2 测定项目及方法
采用乙醇丙酮法测定叶绿素含量；考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白；硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定丙二醛（MDA）含量；NBT 光化还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；脯氨酸含量的测定采用茚三酮比色法，可溶性糖含量的测定采用蒽酮法，过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚显色法，均参照王韶唐的方法；用烘干法测定植株干重。
1.2.3 数据处理
试验测定的数据通过Microsoft Excel和SPSS （13.0）软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同浓度NaCl胁迫对试管苗干重、鲜重的影响
从表1 可以看出，NaCl胁迫条件下，供试材料WT、T1 试管苗的鲜重和干重随着NaCl胁迫浓度的升高呈现下降的趋势；供试材料T2 的干重和鲜重呈现先升后降的趋势。每一处理下未转基因材料WT 的鲜重和干重明显小于转GhABF2基因马铃薯T1、T2的鲜重和干重，说明在NaCl胁迫下，转GhABF2基因材料具有较高的干重和鲜重。当处理浓度为40 mmol/L时，转基因材料T2 的鲜重和干重分别达最大值；当NaCl 浓度为160 mmol/L 时，与对照处理（CK）相比，WT、T1、T2 的鲜重和干重下降趋势明显，达到极显著差异（P＜0.05）。试验结果表明，转GhABF2基因马铃薯在盐胁迫条件下能够显著增加植株鲜重和干重，表现出了较强的抗逆性。
表1 不同浓度NaCl胁迫对马铃薯试管苗干重和鲜重的影响
Table 1 Effects of NaCl with different concentrations on biomass of potato plantlets
2.2 不同浓度NaCl胁迫对试管苗叶绿素含量的影响
图1 不同浓度NaCl胁迫对马铃薯试管苗叶绿素含量的影响
Fig.1 Effects of NaCl with different concentrations on Chlorophyll content of potato plantlets
叶绿素是植物光合色素中最重要的一类色素，其含量可受多种逆境胁迫而下降。从图1 可以看出，随着NaCl 盐胁迫浓度的增加，未转基因材料WT 与转GhABF2 基因材料T1、T2 的叶绿素含量均呈现下降的变化趋势，且两个转GhABF2 基因株系材料T1、T2 叶绿素含量明显低于未转基因材料WT。试验过程中发现，盐胁迫马铃薯试管苗的叶片与对照处理（CK）叶片相比，均出现叶片失绿，同时叶片变薄，说明逆境对马铃薯试管苗影响显著。
2.3 不同浓度NaCl胁迫对试管苗丙二醛含量的影响
图2 不同浓度NaCl胁迫对马铃薯试管苗MDA含量的影响
Fig.2 Effects of NaCl with different concentrations on MDA content of potato plantlets
盐胁迫诱导活性氧的产生并对植物造成氧化胁迫，丙二醛是膜脂过氧化的主要产物，其量的变化可以作为衡量逆境胁迫对植物造成氧化伤害的指标。从图2 可以看出，随着NaCl盐胁迫浓度的升高，非转基因材料WT与转GhABF2基因材料T1、T2的丙二醛含量都呈现先升后降的趋势。且非转基因材料WT 的丙二醛含量明显低于两个转GhABF2 基因株系材料T1、T2，说明在NaCl盐胁迫下，转GhABF2 基因马铃薯表现出较高的抗氧化能力。在盐胁迫浓度为80 mmol/L 时，WT、T1、T2丙二醛含量均达到最大值，转GhABF2基因材料T1、T2 的丙二醛含量分别高于同浓度下WT 的丙二醛含量42.9%和14.3%，且与对照处理（CK）相比都达到了差异显著性（P＜0.05），说明盐胁迫对于转GhABF2基因植株的伤害较小。
2.4 不同浓度NaCl胁迫对试管苗可溶性糖含量的影响
图3 不同浓度NaCl胁迫对马铃薯试管苗可溶性糖含量的影响
Fig.3 Effects of NaCl with different concentrations soluble sugar content of potato plantlets(https://www.daowen.com)
许多的研究结果表明，植物受到干旱胁迫时可溶性糖含量会出现不同程度增加，用于调节并维持植物细胞内外渗透压平衡，保持体内水分，减轻或消除胁迫所造成的伤害。从图3 可以看出，随着NaCl 盐胁迫浓度的升高，WT、T1、T2 可溶性糖含量都呈现上升的趋势。且对照非转基因材料WT 的可溶性糖含量明显低于两个转GhABF2 基因株系材料T1、T2，同时与对照处理（CK）相比都达到了差异显著性（P＜0.05）。
2.5 不同浓度NaCl胁迫对试管苗脯氨酸含量的影响
图4 不同浓度NaCl胁迫对马铃薯试管苗脯氨酸含量的影响
Fig.4 Effects of NaCl with different concentrations on proline of potato plantlets
植物在逆境胁迫下可以导致游离脯氨酸含量增加，盐胁迫下脯氨酸的增加是植物适应盐渍环境的显著特征之一。图4 表明，NaCl 盐胁迫下，WT、T1、T2 的脯氨酸含量随着胁迫程度的增加都呈现上升的趋势，且非转基因材料WT 的脯氨酸含量明显低于两个转GhABF2 基因株系材料T1、T2 的脯氨酸含量。在NaCl 盐胁迫条件下脯氨酸含量的变化趋势显著，NaCl 盐胁迫在浓度为40～80 mmol/L 时，与对照相比，WT、T1、T2 的脯氨酸含量变化趋势呈现不规律变化，上升趋势不显著；当NaCl浓度大于80 mmol/L 时，WT、T1、T2脯氨酸含量增加趋势明显，T1、T2脯氨酸含量与未转基因WT脯氨酸含量相比，分别增加了20.9%和26.7%。说明转GhABF2基因马铃薯在干旱胁迫下具有较强的渗透调节能力。
2.6 不同浓度NaCl胁迫对试管苗可溶性蛋白含量的影响
图5 不同浓度NaCl胁迫对马铃薯试管苗可溶性蛋白含量的影响
Fig.5 Effects of NaCl with different concentrations soluble protein of potato plantlets
同脯氨酸、可溶性糖一样，可溶性蛋白也是一种重要的渗透调节物质。从图5可以看出，随着NaCl 浓度的升高，非转基因植株材料WT 的可溶性蛋白含量明显低于转GhABF2基因株系材料T1、T2 的可溶性蛋白含量，且与对照处理（CK）相比差异均不显著（P＜0.01）。
2.7 不同浓度NaCl胁迫对试管苗SOD酶活性的影响
图6 不同浓度NaCl胁迫对马铃薯试管苗SOD酶活性的影响
Fig.6 Effects of NaCl with different concentrations on SOD activity of potato plantlets
从图6 可以看出，随着NaCl 浓度的升高，WT、T1、T2 的SOD 酶活性都呈增加的趋势。随着NaCl胁迫浓度的增加，非转基因材料WT 的SOD 酶活性明显低于转GhABF2基因材料T1、T2的SOD酶活性，同时与对照处理CK相比都达到了差异显著性（P＜0.05）。
2.8 不同浓度NaCl胁迫对试管苗POD酶活性的影响
图7 不同浓度NaCl胁迫对马铃薯试管苗POD酶活性的影响
Fig.7 Effects of NaCl with different concentrations on POD activity of potato plantlets
从图7 可以看出，随着NaCl 浓度的升高，非转基因植株WT 与转GhABF2 基因株系材料T1、T2的POD 酶活性呈现上升的趋势，但是变化趋势与对照处理（CK）相比，变化趋势均不明显。结果显示，非转基因材料WT 的POD 酶活性低于转GhABF2 基因株系材料T1、T2的POD酶活性，且无显著差异。
2.9 NaCl盐胁迫下马铃薯主要性状指标相关性分析
表2 NaCl胁迫下干物质与主要生理生化指标的相关性分析
Table 2 Correlation analysis on dry matter and biochemical indexes under drought stress
注：*和**分别表示转基因株系与对照在0.05和0.01水平上差异显著。
Note: * and ** meant significant differences between transgenic and untransformed potatos at 0.05 and 0.01 probability levels，respectively.
干物质与各主要生理指标的相关性分析表明（表2），在NaCl 胁迫下未转基因材料WT 的干物质与叶绿素含量呈极显著的正相关关系，与可溶性糖、SOD 酶活性呈极显著的负相关，与可溶性蛋白呈显著正相关，与脯氨酸、POD酶活性呈显著负相关。而转基因株系材料T1 的干物质也与叶绿素含量呈现极显著正相关，与可溶性糖、脯氨酸成极显著负相关。T2 与叶绿素含量也呈极显著正相关，与SOD 酶活性呈极显著的负相关，与可溶性蛋白含量呈显著正相关，与可溶性糖呈显著负相关。说明盐胁迫条件下，马铃薯植株依靠较强的抗氧化和渗透调节能力，减轻了盐胁迫的伤害。
3 讨论
盐胁迫使植物一系列生理过程发生改变，抑制其生长发育。盐敏感性不同的植物在盐胁迫过程中表现出不同的生理变化。因而，研究植物生理过程的变化可以反映植物耐盐的适应性，揭示植物的抗盐机理。本试验结果表明：未转基因材料WT 与转GhABF2 基因马铃薯T1、T2 相比，每一处理下WT 的鲜重和干重都明显小于转基因材料T1、T2，说明在盐胁迫下，转GhABF2基因材料具有较高的生物量，表现出了较强的抗逆性。马铃薯叶片的叶绿素含量都随着逆境胁迫浓度的增加而降低，且两个转GhABF2基因株系材料的叶绿素含量低于对照未转基因植株的叶绿素含量。许多研究表明，盐胁迫下植物叶片中叶绿素含量降低，且随着NaCl 浓度的增大和处理时间的延长，叶绿素降低的幅度加大与本试验结果一致。说明盐胁迫使叶绿素的生物合成过程减弱，另一方面可能是盐胁迫引起植物体内活性氧的累积，导致叶绿素分解加快，进而使叶片绿色变淡。
植物在逆境下往往发生膜脂过氧化作用，破坏了细胞膜的结构，积累了许多有害的过氧化物。MDA 作为膜脂过氧化水平的指标已为人们所接受，膜脂过氧化作用愈强，MDA含量愈高，膜透性愈大，盐胁迫下，MDA 含量随NaCl 浓度的增大而升高。渗透调节能力是植物耐盐性的基本特征之一，可溶性糖和脯氨酸是植物体内两种重要的渗透调节物质。植物叶片内常积累大量的可溶性糖和脯氨酸作为渗透调节剂，使植物细胞保持正常的膨压以缓和盐胁迫危害，维持细胞正常的功能。另外，在盐、干旱胁迫条件下，有机渗透保护物质，如脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白等，可以使细胞保持适当的渗透势而防止脱水，同时对生物大分子的结构和功能起到稳定和保护作用。本试验结果表明，转GhABF2基因马铃薯叶片的脯氨酸含量、MDA 和可溶性糖含量在盐胁迫下随着胁迫强度的增强而显著增加，且转GhABF2基因马铃薯的脯氨酸含量明显高于未转基因材料的脯氨酸含量，这有利于降低植株细胞渗透势，保持植株在逆境胁迫条件下从外界高渗溶液中吸收水分。同脯氨酸、可溶性糖一样，可溶性蛋白也是一种重要的渗透调节物质。随着NaCl浓度的升高，未转基因植株材料的可溶性蛋白含量明显低于转GhABF2 基因马铃薯植株材料，但3 份材料的可溶性蛋白含量随盐浓度的增加而逐渐降低，这与华智锐等研究发现百合转化苗与非转化苗叶片可溶性蛋白质含量都呈逐渐降低趋势，但转化苗叶片蛋白质含量始终都高于非转化苗试验结果基本一致。
盐胁迫下，植物细胞内自由基代谢的平衡被破坏而有利于自由基的产生，过剩的自由基造成的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，使植物膜系统受到伤害。SOD和POD均为植物内源自由基清除剂，属保护酶系统，在逆境中保护酶活性增强或维持较高的水平，才能清除活性氧自由基使之保持较低的水平，维持细胞膜的稳定性和完整性。本试验结果表明，随着NaCl 盐胁迫程度的加重，叶片SOD 和POD 活性逐渐增强，且转GhABF2 基因材料T1、T2 的抗氧化酶活性明显高于未转基因材料WT，说明NaCl 盐胁迫条件下，转GhABF2基因植株依靠较强的抗氧化和渗透调节能力，减轻了盐胁迫的伤害。
4 结论
在NaCl 盐胁迫条件下，两个转GhABF2 基因植株依靠较强的抗氧化和渗透调节能力，减轻了NaCl 盐胁迫的伤害。主要表现在，随着NaCl 盐胁迫程度的增加，两个转GhABF2基因材料植株干重、鲜重明显高于未转基因材料；从生理生化等抗逆指标来看，转GhABF2 基因植株比对照未转基因植株在生长状态、生理生化指标方面都表现出了更强的抗逆性。
参考文献（略）
裴怀弟，李忠旺，张艳萍，陈玉梁：甘肃省农业科学院生物技术研究所