马铃薯X病毒的分子生物学方法检测探究[3]
马铃薯X 病毒（potato virus X，PVX）是马铃薯上重要的病毒之一，主要症状是轻型花叶，病叶稍有波纹，小叶片上有大小不等、形状不规则的黄绿色斑驳，其自然传播主要依靠种薯和介体。据报道，PVX单独浸染马铃薯可降低产量15%左右，与其他病毒混合浸染可引起种薯大量减产，品种退化，严重影响马铃薯生产。
我国防治马铃薯病毒病的主要方法是选育抗病品种，或从我国马铃薯病毒病发病轻的地区调种，或采用组织培养方法生产脱毒种薯等。然而寻求一种好的病毒检测方法将对脱毒苗的检测和病毒的控制起到至关重要的作用。植物病毒的检测除传统的免疫学方法以外，近年发展起来的生物学方法——反转录聚合酶链反应、实时定量PCR等，因其具有灵敏、快速、特异性强，甚至定量的优点，在植物病毒的检测上已经逐渐广泛应用起来。相关的研究国外报道很多，已经达到病毒的拷贝数定量研究以及多种病毒的同时定量检测等，而在我国，应用这些技术检测马铃薯病毒的报道较少，尤其是马铃薯病毒的定量检测相关报道更少。
本试验按照实时定量PCR方法的要求，根据PVX病毒基因序列设计了一对特异性引物，先通过反转录聚合酶链反应，为PVX病毒用分子生物学手段检测探索出一些基础参数。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料：马铃薯病株、健康株均采自甘肃省农科院马铃薯研究所会川马铃薯试验基地。
供试试剂：Trizol 试剂购于Invitrogen 公司；所需的M-MLV 反转录酶、RNA 酶抑制剂（RNasin）购于Promege 公司；Marker、Taq 酶等其他试剂购自TaKaRa 公司；引物由Invitrogen公司合成；其余常用试剂均为国产分析纯。
供试仪器：琼脂糖凝胶电泳系统（JUNYI 600+）、紫外凝胶成像系统（FTI-500）、PCR扩增仪（MJ PTC-100）、台式高速离心机（Heraeus）。
1.2 试验方法
1.2.1 总RNA提取
参照TRIzoI Reagent （InvitrogenTm）说明书，并在此基础上进行改进：取0.1 g 材料，液氮研磨至粉末状，加入1 mL Trizol试剂，充分混匀后迅速转移到1.5 mL离心管中，室温静置5 min；以1 mL Trizol 液加入0.2 mL 的比例加入氯仿，加盖封严，剧烈摇荡15～30 s，室温放置2～3 min；将原方法中4 ℃改进到常温10000 r/min 离心10 min 吸取上清液于一新的离心管，按1 mL Trizol 液加入0.5 mL 的比例加入异丙醇，室温放置10 min；4 ℃改进为常温10000 r/min 离心10 min，留取沉淀，按1 mL Trizol 液加入至少1 mL 的75%乙醇（高压灭菌的超纯水代替原方法中的DEPC水配制）的比例加入预冷的乙醇清洗沉淀，在超净工作台上晾干，改进用ddH2O 代替DEPC 水溶解RNA 沉淀。取3 μL 总RNA 母液，加样于1%的非变性琼脂糖凝胶（代替常规使用的甲醛变性胶）样品槽内，在80 V的电压下，电泳检测RNA质量（图1）。
图1 改进的Trizol法提取的马铃薯总RNA完整性的1%琼脂糖凝胶电泳检测
1.2.2 特异引物的合成
根据Marianne 等发表的PVX 核普酸序列，参照Bright等的研究合成了一对马铃薯PVX病毒的特异性引物：
5′端引物：5′-AAGCCTGAGCACAAATTCGC-3′
3′端引物：5′-GCTTCAGACGGTGGCCG-3′
扩增位点为6110～6210 bp，目标带大小为101 bp。
1.2.3 CDNA的合成
参照Promege 公司提供的反转录酶（M-MLV）操作程序，合成CDNA 的第一条链。取1 μg 的RNA 作为模板，加入20 μmol/L 的3′端引物1 μL，补充RNase-Free 水至12 μL，70 ℃温育5 min，立即置于冰上2 min以上，使RNA与互补引物退火，之后合成CDNA的第二链，在上述反应中加入反转录缓冲液4 μL。10 mmol/L dNTP 2μL，RNasin 20 U，反转录酶1 μL，补充水至20 μL，室温下充分混匀，然后42 ℃温育1 h。(https://www.daowen.com)
1.2.4 PCR扩增
在20 μL 的反应体系中，取上述反转录产物2 μL，加20 μmol/L 的5′端和3′端引物各1 μL，Taq酶缓冲液2 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，1 U Taq酶，加水至总体积20 μL，在PCR 仪上扩增，反应条件是94 ℃预变性3 min，94 ℃变性15 s，设置50.2、51.2、52.6、54.6、56.8、60 ℃的温度梯度复性30 s，72 ℃延伸30 s，设置30、35、40 个不等循环扩增，72 ℃后延伸10 min，取出扩增产物10 μL 进行2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测（图2、3、4）。
图2 马铃薯PVX病毒不同循环数的PCR检测
M：Marker 50 bp；1～3：病毒株30、35、40个循环；4：健康株40个循环
图3 马铃薯PVX病毒不同退火温度的PCR检测
M：Marker 50 bp；1～4退火温度为50.2、51.2、52.6、54.6 ℃；5、6退火温度为56.8、60 ℃
2 结果与分析
2.1 改进方法提取马铃薯总RNA的完整性检测
RNA 样品的凝胶电泳分析是判断RNA 质量的重要手段，从电泳胶上18S和28S的完整性可以判断RNA 有无降解及降解程度，也可以判断有无DNA 污染。试验采用改进的Trizol法提取马铃薯总RNA，利用1%普通琼脂糖凝胶电泳对获得的总RNA样品的完整性进行检测，结果见图1。从图1 可以看出，改进的Trizol 法提取的总RNA 的28S、18S 和5S rRNA条带清晰可见，无弥散现象，也无基因组DNA 的污染。说明改进的Trizol法提取的总RNA降解程度低，且在不用DNA酶消化的情况下，总RNA纯度也较高。
2.2 马铃薯PVX病毒的RT-PCR探究结果
2.2.1 不同循环数的PCR结果
按照上述试验方法中PCR 扩增的基本条件进行了扩增循环数的探究，退火温度选用52 ℃，是根据特异引物序列推算所得理论值。扩增结果从图2可以看出，循环数从30个升至35、40 个，扩增的结果只是在循环数40 个时能够扩增出101 bp 大小的PVX 病毒特异性目标带，健康植株和30、35 个循环时均无特异性条带。扩增结果还显示非特异性条带较多，故退火温度不是最佳条件，需要进行筛选。
2.2.2 不同退火温度的PCR结果
按上述方法中PCR 扩增的基本条件进行了退火温度的探究，扩增循环数为40 个。扩增结果见图3，退火温度从50.2 ℃升至51.2、52.6、54.6、56.8、60 ℃，结果都能扩增出101 bp 大小的PVX 病毒特异性目标带，只是在退火温度为50.2 ℃时，非特异性条带较少，而在其他退火温度，非特异性条带较多。
从PCR 检测图可看出，提取的马铃薯总RNA 反转录PCR 扩增后，电泳检测得到了与预期大小一致的101 bp特异目标带，而对照健康株未出现目标带。
3 讨论
本试验中所采用的RNA 提取改进法，省去了对器皿、水的DEPC处理，只要高温灭菌即可。提取过程均在常温下进行，用普通高速离心机代替了冷冻高速离心机。对提取出的总RNA使用高温灭菌的ddH2O直接溶解，进行质量检测，序列完整，试验结果也表明不影响后续RT-PCR 分子生物学试验。试验中用普通琼脂糖凝胶代替甲醛变性胶，加大电泳的电压，短时间内完成电泳检测，完全可以满足RNA 完整性鉴定的要求。改进的方法，能降低成本，节约时间，方便操作，也避免了使用DEPC 和甲醛等有害试剂，是一种可行的RNA提取方法。
本试验运用RT-PCR 技术，从退火温度、扩增循环数等基础试验参数进行了研究。研究结果显示，退火温度为50.2 ℃，扩增40个循环，能够灵敏、特异地检测到PVX 的存在，方法简单、快速。同时，试验证明所设计的引物特异性很强，PCR扩增时准确地扩增出了101 bp的PVX特异基因片段。所以这套参数不仅可用于马铃薯PVX的RT-PCR 检测，也为PVX的定量检测奠定了一些基础。
参考文献（略）
张艳萍，厚毅清，裴怀弟，王红梅，陈玉梁：甘肃省农业科学院生物技术研究所