基因克隆的载体
各种工具酶的发现和应用解决了DNA 体外克隆和重组的技术障碍，但是获得基因还必须回到细胞内才可以进行复制与表达，因为DNA 片段在体外不具备自我复制的能力。克隆的外源基因若想进入生物细胞进行复制与表达，需要运载工具——载体（vector）。载体就是携带外源DNA 进入宿主细胞，并在宿主细胞内进行无性繁殖或表达的小分子DNA。载体按照功能可以分为两大类：克隆载体和表达载体。克隆载体用于在宿主细胞内克隆和扩增外源DNA 片段；表达载体用于在宿主细胞内获得外源基因的表达产物。载体由不同的元件组成，它们分别来自细菌质粒、噬菌体DNA 或病毒DNA 等。按照载体基本元件来源，载体又可以分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体载体等类型（表2-1）。
表2-1 载体的种类和特征
作为基因工程的载体，必须具备如下性能：
（1）分子较小，能独立于染色体进行高效自主复制；
（2）具备尽可能多的单一的酶切位点，以便连接、插入进所克隆的DNA片段；
（3）有一个或多个标记，易于选择；
（4）构建进外源DNA插入后，载体的复制不受影响；
（5）本身对受体细胞无害，及能接纳大的外源DNA片段；
（6）有时要求载体具有促进外源性DNA 表达的调控区，能启动外源基因进行转录及表达；
（7）生物防护安全，载体不会随便转移，不污染环境。
1.质粒载体
质粒是存在于细菌细胞质中，独立于染色体之外，具有自主复制能力的遗传成分。除了极为罕见的线性质粒和RNA 质粒外，多以环状双链形式存在。质粒结构比病毒还简单，既没有蛋白质外壳，也没有细胞外生命周期，但是它能在宿主细胞内独立繁殖，并随宿主细胞的分裂遗传下去。质粒不是宿主细胞生长所必需的，但是它可以赋予宿主细胞抵抗外界不利因素的能力。质粒载体是以细菌质粒的基本元件为基础构建而成的基因工程载体，是基因克隆中不可缺少的载体。
质粒的分子大小不等，小的只有2～3 kb，大的可以达到数百千碱基，差距可达上百倍。每个质粒都有一段起始位点序列，有助于质粒DNA 在宿主细胞内独立自主地进行复制，并在细胞分裂时传到子代细胞。在体内，质粒DNA 具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA），即SC 型质粒，这样的质粒保持着完整的环形结构，呈超螺旋的SC 构型；开环DNA（ocDNA），即OC构型，这类构型的质粒的一条链保持完整的环形结构，另一条链存在缺口；线性分子（cDNA），通称L 构型，这类质粒的双链断裂。不同构型的同一种质粒DNA 在琼脂糖凝胶电泳中，具有不同的电泳迁移率，最前沿的为scDNA，LDNA其次，ocDNA最后。
根据质粒DNA 复制与宿主间的关系，可将质粒分为“严紧型”复制控制的质粒和“松弛型”复制控制的质粒两种。“严紧型”质粒的复制受到宿主DNA 复制的“严格控制”，二者紧密关联，故在宿主细胞内质粒拷贝数较少，通常为1～3 个。“松弛型”质粒受到的控制比较松，通常具有较高的拷贝数，一般每个细胞内可以有10～200个，甚至可达700多个。
根据质粒分子遗传特性的不同，质粒也可以分为接合型质粒（自我转移质粒）和非接合型质粒（不能自我转移质粒）。接合型质粒除了带有自我复制的遗传信息外，一般还带有tra 基因或者其他协助质粒转移的基因，在培养过程中，可以从一个细菌传递到其他细菌；非接合型质粒仅带有自我复制的遗传信息，不具有辅助转移的基因，不能自主地在细菌间转移，但在一些情况下，两种质粒共存于同一细菌时，非接合型质粒可以和接合型质粒一起在菌间转移。
两种亲缘关系密切的质粒在没有选择压力的情况下，不能长期稳定地共存于同一细胞内，这一现象成为质粒不相容性。反之，两种质粒可以长期稳定存在于同一细胞内，能够一起复制并共存的现象称为质粒的相容性。质粒复制过程中质粒不相容性有时存在，但是大部分都表现为质粒相容性，已有结果表明，大肠杆菌中可以同时存在七种质粒。目前，质粒不相容性机制还不清楚，但一般认为，具有相同和相近复制起始点是质粒不相容的一个原因。相容质粒可能是因为具有不同的复制系统，在复制过程中不存在竞争。
质粒家族庞大，种类繁多，但是都具遗传物质传递和交换能力。天然质粒是指没有经过人为体外修饰改造的质粒。大肠杆菌中，常见用于克隆的天然质粒有RSF2124、pSC101和ColE1等，其中pSC101是第一个用于基因克隆的天然质粒。由于天然质粒存在不同程度的局限性，所以人们为了更好地利用质粒，以天然质粒元件为基础，重新组建了人工质粒。一般说来，理想的用于克隆的质粒载体分子量相对较小，具有有效的复制起点，具有多克隆位点，带有便于筛选的抗性基因等特点。(https://www.daowen.com)
在基因克隆中，目前应用的质粒载体为：
（1）质粒克隆载体pBR322 质粒、pUC18/19 质粒、pGEM-T、pGEM-T Easy 载体、pSP64和pSP65质粒载体等；
（2）质粒表达载体pBV220载体、pET载体、融合蛋白表达载体pGEX载体和非融合型表达蛋白载体pKK23-3载体；
（3）穿梭质粒载体，有人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同寄主细胞内存活和复制的质粒载体。
2.噬菌体载体
噬菌体是细菌病毒的总称，即感染细菌的病毒，它们的结构与细菌或真核生物相比显得十分简单，但比质粒复杂得多。噬菌体DNA 分子中，除具有复制起点外，还有编码外壳蛋白的基因。噬菌体严格依赖细菌宿主细胞的生长和繁殖，离开宿主细胞尽管可以生存，但是不能生长和复制。噬菌体基因组大部分是双链线性DNA，少数为单链环形、单链线性DNA及单链RNA等形式存在。
噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期两种不同类型。溶菌周期是指噬菌体吸附寄主表面，注入DNA，使DNA 在宿主体内复制及蛋白质合成，并组装成自带噬菌体颗粒，最后导致寄主细胞破裂，释放子代溶菌体颗粒。溶源周期是指噬菌体DNA 整合到寄主染色体中，成为它的一部分。只具有溶菌周期的噬菌体称为烈性噬菌体，具有溶源周期的噬菌体称为温和噬菌体。
由于噬菌体载体不会由于外源插入片段过大导致不稳定或转化效率下降，所以利用噬菌体载体可以有效地克隆较大的DNA 片段，利于DNA 文库和cDNA 文库的构建。天然存在的噬菌体质粒往往也存在限制酶切位点过多等问题，所以在天然噬菌体载体结构基础上构建了多种噬菌体载体。目前应用比较广泛的噬菌体载体有λ 噬菌体载体、Charen 噬菌体、柯斯质粒载体、M13单链噬菌体载体、噬菌粒载体和噬菌体-质粒杂合载体等。
3.酵母载体
酵母载体是指可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单元。酵母质粒是由Sinelari于1967年在啤酒酵母中首次发现的，因其长度为2 μm，故被称为2μ 质粒。酵母质粒载体有克隆载体和表达载体，但由于酵母内克隆不及在大肠杆菌中克隆，故常构建穿梭载体，以实现在大肠杆菌中克隆，酵母内表达。常用的酵母质粒载体有Yip型载体、YRp型载体、YCp型载体、YEp型载体等。
除了上述酵母质粒载体，人们还用人工方法按酵母染色体不可缺少的主要片段组建了酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC），用于在酵母细胞中克隆外源DNA 大片段。
YAC的基本结构是：
（1）着丝粒，它负责在细胞分裂过程中染色体在各子细胞中的正确分配；
（2）端粒，位于染色体末端，利于染色体末端完全复制和防止染色体被核酸外切酶降解；
（3）自主复制起始序列，类似于质粒复制起点；
（4）筛选标记，用于在酵母中鉴别筛选；
（5）限制酶切位点，便于外源DNA 插入。YAC 主要用来构建基因文库，特别是利用其构建高等真核生物的基因组文库。