农杆菌介导转化的基本原理

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）都是革兰阴性菌，同属于根瘤菌科（Rhizobiaceas）农杆菌属（Agrobacterium）。根癌农杆菌感染植物细胞后诱导冠瘿瘤及合成冠瘿碱，故称含Ti质粒。发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，所以称为毛状根，含Ri质粒。

根癌农杆菌是最早应用于植物转基因研究的，转化机理在于根癌农杆菌细胞内存在一种特殊的能转移并能整合到植物基因组的Ti质粒。Ti质粒能够诱导植物伤口产生肿瘤，把本身的一段DNA 转移至植物细胞，整合进植物基因组，表达，并能在植物后代遗传。Ti质粒分为4 个功能区域：T-DNA 区（transferred-DNA regions）、Vir 区（virulence region）、Con 区（regions encoding conjugations）和Ori 区（origin of replication）。T-DNA 区是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，该片段上的基因与肿瘤的形成有关。Vir 区的基因能激活T-DNA 的转移，使农杆菌表现出毒性。Con 区调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移，该区段存在着与细菌接合转移的有关基因。Ori 区基因调控Ti质粒的自我复制。

Ti 质粒附着到植物细胞后，并非整个进入植物细胞，而是先留在细胞间隙中。首先T-DNA 在细菌中被加工、剪切、复制。T-DNA 是以T 链的形式向植物细胞转移的。Vir 区的VirD1 和VirD2 两种蛋白一起决定内切酶活性，在25 bp 重复序列的右边界左起第3 和第4碱基间缺口剪切，然后从缺口3′端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22个碱基处，置换出原来的DNA 链，形成ssDNA，即T 链。然后转入植物细胞。T 链横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜及核膜，整合进植物基因组（图3-1，Rossi 等）。在此过程中，T 链必须避免被核酸酶降解，因此可能以DNA-蛋白复合体的形式存在，在此过程中，VirD2 和Vir保护T 链并对T 链的转运起向导作用，还有其他活性物质在T链的转运中也发挥了重要作用。

图3-1　T-DNA的加工、转运和整合的途径（修改自Rossi et al）

发根农杆菌的转化过程与根癌农杆菌类似：首先Ri 感染植物伤口后，植物受伤组织产生乙酰丁香酮等酚类化合物，这些物质诱导Ri 质粒的Vir 区基因被活化。接着在Vir 区基因表达产生的酶作用下Ri质粒上的T-DNA 被切割下来并转入植物细胞。随后T-DNA 整合到植物基因组DNA。(https://www.daowen.com)

农杆菌介导植物转化的一般程序是：

（1）含目的基因的植物表达载体构建，将目的基因导入植物表达载体T-DNA区；

（2）将植物表达载体导入农杆菌菌株；

（3）利用农杆菌侵染植物受体细胞；

（4）对转化组织进行筛选、检测。