基于PCR扩增的DNA标记
PCR 即聚合酶链式反应，是一种利用酶促反应对特定DNA 片段进行复制扩增的核酸合成技术，它的实质是体外合成特异性DNA 片段，又称无细胞分子克隆系统。PCR 扩增DNA 片段由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究。
以PCR 为核心的分子标记技术，包括随机引物PCR 标记和特异引物PCR 标记。随机引物PCR 标记就是反应中采用的引物的核苷酸序列是随机的（长度为9～10 个核苷酸），它所扩增的DNA 区段是事先未知的，应用这种技术可在基因组中寻找未知的多态性位点作为新的DNA 标记，此类标记有随机扩增多态性（Random Amplified Polymorphism，RAPD）、DNA 扩增指纹印记（DNA Amplification Fingerprinting，DAF）等；特异性引物的PCR 标记即以重复顺序为基础的，用的是RAPD 是标记，DAF 标记、AP-PCR 标记应用不多。特异引物PCR 标记的引物是特异的，它与随机引物PCR 的区别在它所用的引物是针对已知序列的DNA 区段而设计的，具有特定的核苷酸序列，引物长度为18～24 个核苷酸。特异引物PCR 标记根据引物来源不同，分为简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）、序列特异性扩展区（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR）和序列标志位点（Sequence Tagged Sites，STS）等，其中，RAPD和SSR标记应用最为广泛。
1.RAPD标记
RAPD即随机扩增多态性DNA （Random Amplification Polymorphism DNA，RAPD），该技术是在1990年由Williazm 等人以DNA聚合酶链式反应为基础而提出的，RAPD 标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（通常长度为10 个核苷酸）通过PCR 扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。
（1）RAPD标记的原理（见图6-2）
RAPD标记是建立于PCR技术基础之上，即根据DNA双链分子在高温下变性解链、较低温度下复性（退火）以及在适温下延伸的性质，利用寡核苷酸随机引物对基因组DNA进行PCR 扩增，扩增产物凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，显示扩增产物DNA 片段的多态性。RAPD 标记使用10 个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA 全部进行PCR 扩增，引物结合位点DNA 序列的改变以及两个扩增位点之间DNA 碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，呈现出多态性。
（2）RAPD标记的技术流程
①植物基因组DNA提取。
②PCR 反应体系，25 μL 反应体系中包含Template DNA（10 ng/μL）1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Random Primer （10 μmol/L）1 μL，10 μmol/L dNTP 0.5 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.2 μL，加dd H2O至25 μL，加样完毕后加盖混匀，放入PCR仪。
③PCR 反应程序：PCR 仪中预变性94 ℃3 min，45 个循环（94 ℃30 s，36 ℃40 s，72 ℃45 s），循环结束后，72 ℃10 min，反应结束，4 ℃保存。
④电泳检测：在PCR 产物中加5 μL 6×上样缓冲液，于1.5% 琼脂糖胶上电泳，稳压80～100 V，电泳结束，溴化乙锭染色20 min，用凝胶成像仪观察、拍照，条带统计分析。
图6-2 RAPD标记原理示意图
1.为显性标记；2、3、4.为共显性标记
（3）RAPD标记的特点
①检测未知序列的基因组DNA
RAPD 标记无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，引物可随机合成和随机选定，一般采用一系列随机引物对基因组进行检测，因而能检测多个基因位点，信息覆盖率比较大，虽然每条引物检测基因组DNA 多态性的区域是有限的，但利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，RAPD 多态信息含量（PIC）值波动较大，在0.2～0.9之间。
②遗传特性
RAPD 标记一般表现为显性遗传，极少数表现为共显性遗传。显性遗传基因位点符合孟德尔遗传定律，不能鉴别出杂合子和纯合子。
③引物无种族特异性
RAPD 引物一般为10个碱基长，人工合成成本低。每个反应体系中仅加单个引物，就可通过引物和模板DNA 随机配对实现扩增，扩增无特异性。RAPD引物没有严格的种属界限，同一套引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。
④RAPD技术简单
RAPD 技术简便易行，省时省力，由于使用DNA扩增仪，操作自动化程度高，分析量大，且免去了RFLP 中探针制备、同位素标记、Southern 印迹及分子杂交等烦琐步骤，分析速度很快。RAPD 分析所需样品量少（一般5～10 ng），对DNA 质量要求较RFLP 低。同时，RAPD标记还可转化为SCAR及STS等表现为共显性的分子标记。
（4）RAPD标记的缺点
RAPD 标记技术易受各种因素影响，试验的稳定性和重复性差。模板的质量和浓度、PCR 反应体系、PCR 的循环次数、基因组DNA 的复杂性和技术设备等，都有可能是造成RAPD技术重复性差的原因。可从以下几个方面来提高反应的稳定性：
①RAPD 标记对试验条件摸索和引物的选择十分关键，研究人员应对不同物种做大量的探索工作，优化确定每一物种的最佳模板DNA、引物、Mg2+浓度及试验条件。理想的PCR反应参数能产生多态性丰富、强弱带分明的RAPD图谱。
②规范操作，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD 反应标准化，试验条件标准化可以提高RAPD标记的再现性。
③将RAPD 标记转化为SCAR 标记后再进行常规的PCR 分析，可以提高反应的稳定性及可靠性。
2.SSR标记（见图6-3）
简单序列重复（SSR），也叫微卫星DNA（microsatellite DNA），是由Hamade 于1982年发现。SSR 是一类由1～6 个核苷酸为基本单元经多次串联重复得到的DNA 序列，串联重复次数一般为10～50 次，序列长度在100～200 bp之间。这些简单重复序列绝大部分随机、均匀、广泛地分布于真核生物的基因组上，由于重复次数不同，从而造成简单序列长度多态性。不同物种的SSR 序列在长度、组成、重复次数、突变率和在染色体上的分布情况呈高度多态性，反映出高度的等位基因多样性。微卫星广泛分布于真核生物的整个基因组中，包括编码区和非编码区，平均23.3 kb就有一个SSR，且在不同基因组中的分布差异很大（Zhang et al，2007）。
（1）SSR标记的原理
尽管微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的侧翼序列是相对保守的单拷贝序列。因而可以将微卫星侧翼的DNA 片段克隆、测序，然后根据微卫星侧翼两端高度保守的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR 技术，扩增每个位点的微卫星DNA 序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般地，同一类微卫星DNA 可分布于整个基因组的不同位置上，而通过其重复的次数不同以及重复程度的不完全而造成每个座位的多态性。目前，SSR 标记技术已被广泛用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测，以及目标性状基因标记筛选等领域。
图6-3 微卫星克隆的分离及SSR标记产生示意图
A.SSR标记的检测；B.微卫星克隆的分离
（2）SSR标记的技术流程
①植物基因组DNA提取。
②PCR 反应体系，25 μL 反应体系中包含Template DNA（10 ng/μL）1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Primer L （10 μmol/L）1 μL，Primer R （10 μmol/L）1 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.2 μL，加dd H2O至25 μL，加样完毕后加盖混匀，上样。(https://www.daowen.com)
③PCR 反应程序：样品预变性94 ℃3 min，35 个循环（94 ℃30 s，45～63 ℃45 s，72 ℃45 s），循环结束后，72 ℃10 min，反应结束，4 ℃保存。
④电泳检测：SSR 标记PCR 产物如果目标条带数量和分子量大小明确，则可采用1.0%琼脂糖凝胶电泳（有效分离范围0.2～20 kb）来检测，若目标产物条带未知，则采用5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（适合检测5～500 bp DNA片段）可提高分辨率和检测效率。
下面介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳操作方法及步骤：
a.电泳玻璃板准备
1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，用酒精擦干，干燥。在平板上均匀涂上300～500 μL的0.5%的亲和硅烷Binding Silane。可放置过夜。
2）配制凝胶前，在凹板上均匀涂上2%的剥离硅烷Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都均匀涂到，晾干（至少5 min），然后用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。
3）玻璃板干燥后进行组装。平板涂有亲和硅烷的一面向上置于实验台上，沿两边边缘放置配套胶条，凹板涂有剥离硅烷的一面朝下放置在平板上，调整玻璃板与胶条位置至完全对齐时，使用制胶夹子左右对称夹住玻璃板两边，将装好的玻璃板放置于实验台上，保证玻璃板的水平。
b.聚丙烯酰胺凝胶的制备
1）胶的用量：视玻璃板的大小而定，一般60 个样品的电泳装置凝胶配制量为Urea-TBE 51 mL，40%Acr-Bis 9 mL，10%APS（新鲜配制）400 μL，TEMED 30 μL。
2）加样完毕后迅速轻轻摇匀，注意不要用力搅拌，混匀后立即灌胶。
3）将混合液导入大注射器中，将导管中气泡挤出，迅速将导管口插入灌胶口，缓慢匀速推动活塞，使混合液流入两块玻璃板之间，人为控制流速以防止气泡产生，灌满后凹板端反向插入电泳梳以保证胶面水平。
4）灌胶完成后，聚合时间至少1 h。若凝胶要放置过夜，则须在凝胶两头覆上保鲜膜以防止凝胶变干，4 ℃保存。凝胶使用之前可保存1～2 d。
c.凝胶电泳
1）正极槽（下槽）中加入600 mL的1×TBE 缓冲液，组装上配好凝胶的玻璃板，负极槽上加入800 mL的0.5×TBE缓冲液直至凹板边缘。
2）拔去维持凝胶上方水平的电泳梳，将凝胶上方多余的胶用枪冲洗干净，并将气泡清除。
3）预电泳30 min，保持在恒定功率60 W（相当于电压1500 V，电流40 mA）。
4）预电泳完成后，关闭电源，用加样枪将凝胶上方多余的气泡和胶清除干净，正向插入梳子，再用枪将梳子中的气泡清除干净。
5）加入5 μL 样品PCR 反应液，每块板点1～2 个DNA 标准分子量Marker，60 W 恒定功率电泳大约1 h，至第一条Loading buffer 指示带（二甲苯青带，约相当于260 bp 双链DNA）跑至胶板的2/3处（距底部1/3处）时停止电泳，关闭电源。
6）通过带电极玻璃板中部的出水孔排出0.5×TBE 缓冲液，剩余的0.5×TBE 缓冲液直接倒掉，缓冲液可反复使用几次。
7）小心地分开两块玻璃板，这时凝胶会粘连在涂有亲和硅烷的玻璃板上。
d.银染
1）固定：将带凝胶的玻璃板浸在固定液（10%乙醇，0.5%冰醋酸）中20 min，凝胶朝上放置，盒子可放在摇床上缓慢摇动。
2）银染：将玻璃板取出，浸在染色液［10%乙醇，0.5%冰醋酸，0.2%AgNO3 （ACS试剂）］中15 min，凝胶朝上放置，盒子可放在摇床上缓慢摇动。
3）洗板：用自来水（最好用双蒸水）短时间（5～10 s）冲洗玻璃板两面，玻璃板须离水近些，否则凝胶容易变黑。
4）显影：将凝胶浸在显影液（3%NaOH，0.1%甲醛）中显影20～30 min，直至带纹出现。凝胶朝上放置。
5）洗板：用自来水（最好用双蒸水）冲洗凝胶2遍，每次2 min。
6）晾干：室温下自然干燥，干燥后的胶板覆盖保鲜膜，可以永久保存，也可以进行拍照记录。
（3）SSR标记的特点
SSR是一种较理想的分子标记，与其他分子标记相比，它有以下几方面特征：
①SSR 标记的数量极为丰富，可以检测几乎整个基因组的遗传信息。
②信息含量高，多态性位点丰富，并且是位点特异性的分子标记。
③以孟德尔方式遗传，呈共显性，不易被自然选择和人工选择所淘汰，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。
④兼具PCR反应的优点，所需DNA样品量少，对DNA质量要求不高。
⑤兼具PCR反应的优点，所需DNA 样品量少，对其质量要求不高。
⑥试验重复性好，结果稳定可靠，便于进行数据比较。
⑦试验程序操作简单，低成本高效率，能够用于大批量的基因组序列分析，可以广泛用于各个方面的研究。
（4）SSR标记的不足
使用SSR 技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA 序列的信息，这可以在其他种的DNA 数据库中查询。但开发新的SSR 标记必须针对每个染色体座位的微卫星，从其基因组文库中发现可用的克隆，进行测序，以其两端的单拷贝序列设计引物，开发技术成本高（SSR 设计引物时需要构建cDNA 文库，并进行大量的测序，成本昂贵）。随着更多的SSR 多态性位点的开发及SSR 标记技术的进步，这一有价值的分子遗传标记技术必将用于更多的植物分子标记中。