Ta6-SFT在烟草中的逆境诱导型表达及抗旱[2]
目前已从小麦、大麦、冰草、菊芋、葛首等植物中克隆了果糖基转移酶基因并开展了相关的基因功能和转基因研究。高翔等、李慧娟等和Bie等都以CaMV35S启动子驱动Ta6-SFT（蔗糖：果聚糖-6-果糖基转移酶基因）、1-SSZ（蔗糖：蔗糖-1-果糖基转移酶基因）和Tal-FFT（果聚糖：果聚糖-1-果糖基转移酶基因）在烟草中的组成型表达，提高了转基因烟草的抗旱、抗盐和抗低温能力。张小芸以玉米Ubi-1 启动子驱动冰草1-FFZ 在黑麦草中表达，王正鹏等构建了在茎秆中特异性表达的连接有转运肽序列的番茄rbcs启动子驱动的菊芋1-SST植物表达载体。
本研究以来自抗旱小麦品种扬麦6号的Ta6-SFT为目的基因，构建CaMV35S启动子驱动的Ta6-SFT 组成型表达载体和rd29A 启动子驱动的逆境诱导型表达载体，并分别导入烟草，比较干旱胁迫下2 种启动子驱动的Ta6-SFT 转基因株系的相对表达量和果聚糖含量，分析株高等部分农艺性状指标，筛选烟草中Ta6-SFT的高效表达方式，为植物中高效表达外源果糖基转移酶基因和抗逆相关基因提供理论依据和参考，同时也可为果聚糖在植物抗旱中的作用提供形态的和分子的证据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
烟草（Nicotiana tabacum）组培苗NC89、植物表达载体pCAMBIA3300、大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株LBA4404 均由甘肃省农业科学院生物技术研究所实验室保存。Tab-SFT、rd29A 启动子分别由中国农业科学院作物科学研究所叶兴国博士和甘肃农业大学生命科学院司怀军博士惠赠。
1.2 植物表达载体构建
1.2.1 组成型植物表达载体pCAMBIA-6-SFT的构建
用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ从pBI121-6-SFT载体中将2938 bp的CaMV35S启动子、Tab-SFT和nos 终止子DNA 大片段（简写为P35S-6-SFT-Tnos，以下同）酶切下来并回收；同时用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切消化pCAMBIA3300 质粒，用P35S-6-SFT-Tnos 片段替换pCAMBIA3300 载体上的P35S-Tnos片段，构建成pCAMBIA-6-SFT植物表达载体（图1）。
图1 pCAMBIA-6-SFT植物表达载体结构简图
Fig.1 Sketch of plasmid pCAMBIA-6-SFT
1.2.2 诱导型植物表达载体pCAMBIA-rd29A-6-SFT的构建
将CaMV35S 启动子片段从植物表达载体pCAMBIA-6-SFT 上用HindⅢ和BamHⅠ酶切下来，用rd29A启动子代替，构建成pCAMBIA-rd29A-6-SFT载体（图2）。
图2 pCAMBIA-rd29A-6-SFT植物表达载体结构简图
Fig.2 Sketch of plasmid pCAMBIA-6-SFT
1.3 转Ta6-SFT烟草植株的获得及分子检测
将pCAMBIA-6-SFT 和pCAMBIA-rd29A-6-SFT 质粒DNA 用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，用草胺膦25mg/L筛选再生植株。对获得的抗性植株进行PCR、Southern 杂交和Northern 斑点杂交分子检测。以含Ta6-SFT 质粒为阳性对照，非转基因烟草为阴性对照，提取的草胺膦抗性植株基因组DNA 为模板，以Tab-SFT 特异引物进行PCR 扩增。上游引物5′-CTGGATATCATGGGGTCACACGGCAAGCC-3′，下游引物5′-GGACTAGTTCATTGAACATACGAGTGATC-3′，PCR产物长度为1851 bp。
Southern杂交以地高辛标记的Ta6-SFT全长为DNA探针，HindⅢ酶切PCR检测阳性的转基因烟草基因组DNA，参照Roche 公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection starter Kit I （货号：11745832001）说明书操作。Northern斑点杂交以Ta6-SFT全长为DNA探针，将Southern杂交呈阳性的转基因株系的总RNA变性后固定在尼龙膜上，杂交、免疫检测等步骤同Southern杂交。
1.4 Ta6-SFT在转基因株系中的表达分析
挑选Southern 杂交和Northern 斑点杂交呈阳性的转基因株系进行干旱胁迫。取0～20 cm 表层土壤过筛混匀，用称重法测土壤含水量。装盆，盆高为30 cm，上口径28 cm，下口径22 cm，每盆装干土20 kg。参试的转基因烟草株系通过无性繁殖，挑选长势一致的植株随机盆栽，每盆栽3 株，为3 次重复。待烟草植株长到七叶一心期浇水至盆中土壤含水量达25%，开始干旱胁迫，一直持续18 d，处理期间不浇水。
提取胁迫0 d 和18 d 各转基因株系和非转基因对照叶片总RNA，参照Invitrogen Gold Script cDNA 合成试剂盒（货号：c81401190）合成cDNA 第一链。以烟草actin 基因（gi：50058114）为内参，采用半定量RT-PCR 分析Ta6-SFT 在干旱胁迫不同时期的转录水平表达。烟草actin 基因上游引物5′-TCCATGCTCAATGGGATACT-3′ ，下游引物5′-TTCAACCCCTTGTCTGTGAT-3′。Ta6-SFT引物同前。
1.5 果聚糖含量、细胞膜透性和丙二醛（MDA）含量的测定
取干旱胁迫0 d和18 d各转基因株系和非转基因对照同一叶位叶片，利用GENMED 植物果聚糖化学比色法定量检测试剂盒（货号：GMS 19023.1v.A）测定果聚糖含量，参照《植物生理学实验指导》电导法测定细胞质膜透性和硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA 含量。
1.6 转基因烟草的农艺性状测定
用直尺测量干旱胁迫0 d 和18 d 各转基因株系和非转基因对照的株高，用螺旋测微器测1/2 株高处茎粗（以下简称茎粗），直尺测量1/2 株高处上下相邻3 片真叶的最长和最宽处，烟草叶而积=0.6435×叶长×叶宽。
1.7 数据分析
利用Microsoft Excel软件绘图，并用DPS 7.05软件的SSR法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 转Ta6-SFT烟草植株的获得和分子检测
PCR 检测获得了CaMV35S 启动子驱动Ta6-SFT 的组成型表达的转基因烟草12 株（编号S1、S3～S13），rd29A 启动子驱动Ta6-SFT的逆境诱导型表达的转基因烟草10株（编号R1～R10）。取9株进行了Southern 印迹杂交，以有杂交信号的5株进行Northern 斑点杂交。图4和图5说明Ta6-SFT已经整合到这5个植株的染色体上（图4），并得到了转录（图5）。
图3 转基因植株的PCR检测结果
Fig.3 PCR detection result of trandgenic lines
M：DNA maker D2000；P：阳性对照；N：阴性对照；1～7：转pCAMBIA-rd29A-6-SFT 草胺膦抗性植株；8～15：转pCAMBIA-6-SFT草胺膦抗性植株
M: DNA maker D2000；P: positive control；N: negative control；1-7: Glufosinate resistant plants transformed with pCAMBIA-rd29A-6-SFT；8-15:Glufosinate resistant plants transformed with pCAMBIA-6-SFT
图4 转基因植株的Southern杂交部分结果
Fig.4 Southern blot of transgenic lines
M：地高辛标记的DNA makerⅡ；P：阳性对照；N：阴性对照；1：R2；2：R3；3：R5；4：S9；5：S13
M:DIG labeled DNA makerⅡ；P:positive control；N:negative control；1:R2；2:R3；3:R5；4:S9；5:S13
图5 转基因植株的Northern斑点杂交结果
Fig.5 Northern dot blot of transgenic lines
P：阳性对照；N：阴性对照；1：R2；2：R3；3：R5；4：S9；5：S13
P:positive control；N:negative control；1:R2；2:R3；3:R5；4:S9；5:S13
2.2 干旱胁迫下转基因烟草中Ta6-SFT的表达(https://www.daowen.com)
Ta6-SFT 的半定量RT-PCR 分析结果表明，干旱胁迫0 d 和18d 各转基因株系中Ta6-SFT 都能被正常转录。干旱胁迫0 d，逆境诱导型表达转基因株系R2、R3、R5 中Ta6-SFT微量表达，而组成型表达转基因株系S9和S13中Ta6-SFT表达水平明显高于R2、R3、R5。干旱胁迫18 d 时，R2、R3、R5 中Ta6-SFT 表达较干旱胁迫0 d 时明显升高，尤其是R2 株系，S9和S13中Ta6-SFT表达较干旱胁迫0 d时不变或略有降低（图6）。
图6 干旱胁迫时转基因烟草半定量RT-PCR分析
Fig.6 Semi-quantitative RT-PCR of transgenic lines under drought stress
以上说明rd29A 启动子驱动的Ta6-SFT 逆境诱导型表达转基因株系只有在遭受逆境时才启动外源基因的正常转录和表达，而CaMV35S 启动子驱动的Ta6-SFT 组成型表达转基因株系在任何条件下外源基因都处于转录的激活状态。
2.3 干旱胁迫对转基因株系中果聚糖含量的影响
图7所示，干旱胁迫0 d，转基因株系R2、R3、R5的果聚糖含量与非转基因对照无显著差异，S9、S13的果聚糖含量与对照具显著差异，分别高于对照20.0%、21.2%。干旱胁迫18 d时各转基因株系和对照中果聚糖含量较胁迫前都提高了，果聚糖含量为R2 ＞R5＞R3＞S13＞S9＞CK，除S9 外，转基因株系显著高于对照（图7），尤其是R2 株系。与非转基因材料相比，R2、R3、R5株系果聚糖含量分别增加5.21、2.17和3.23倍，S9、S13株系分别增加1.1倍和1.7倍（表1）。
图7 干旱胁迫对转基因株系果聚糖含量的影响
Fig.7 Fructan concentration of the transgenic lines under drought stress
注：柱形图上不同字母表示株系间差异达到0.05 的显著水平。
Note:Bars superscripted by different letters are significantly different at P＜0.05.
表1 干旱胁迫后烟草各株系果聚糖、细胞膜透性和丙二醛的变化
Table1 Changes of fructan，cell membrane permeability，and MDA in transgenic lines under drought stress
续表1
注：表中数据为平均数±标准误，同一列中标以不同小写字母的值在0.05 水平上差异显著（P ＜0.05）。
Note: The data are mean ± SE，values within a column followed by different letters are significantly different at P ＜0.05.
数据表明，正常生长条件下逆境诱导型表达转基因株系R2、R3、R5 中Ta6-SFT 有微量表达，当遭受逆境胁迫时，Ta6-SFT 的表达被激活，表达量大幅上调。组成型表达转基因株系S9、S13在正常生长条件和逆境胁迫下Ta6-SFT 都有一定表达，在逆境胁迫时Ta6-SFT 的表达量并不比正常条件下有所增强。由此说明逆境诱导型的转基因株系在应对非生物胁迫时可以更好地协调植物体内的物质和能量分配，实现物质和能量的高效利用。
2.4 干旱胁迫对转基因株系部分农艺性状的影响
干旱胁迫0 d，各植株长势旺盛，形态正常。干旱胁迫持续到18 d 时，转基因株系及非转基因对照都表现出不同程度的萎蔫和叶片皱缩的现象，后者更严重。这些外部形态与测定的株高、茎粗、叶面积数据相一致（图8、图9和图10）。表2表明，如设定非转基因对照在干旱胁迫期间的株高和茎粗的增长量均为100%，则rd29A启动子驱动的Ta6-SFT的逆境诱导型表达转基因株系R2、R3、R5的株高增长量分别是193.4%、149.2%和213.1%，茎粗的增长量是736.9%、161.2%和1399%；CaMV35S 启动子驱动的Ta6-SFT 的组成型表达转基因株系S9 和S13 的株高增长量分别是144.3%和180.3%，茎粗增长量是367%和336%。
各株系叶面积在干旱胁迫18 d 后有不同的变化趋势，非转基因对照的叶面积较胁迫前平均减小4.00 cm2，转基因株系R2、R3、R5胁迫后叶面积小幅增加，S9稍有减小，S13基本无变化（表2和图10）。
综合干旱胁迫下转基因株系株高、茎粗和叶面积的增长量分析说明，干旱胁迫对转基因烟草株系生长的影响小于非转基因对照，且rd29A 启动子驱动的Ta6-SFT 转基因株系的生长势强于CaMV35S启动子驱动的Ta6-SFT转基因株系。
2.5 细胞质膜透性和丙二醛含量变化
在正常生长情况下，转基因株系和非转基因对照的细胞质膜透性无显著差异（P＜0.05）（图11）。表明Ta6-SFT 在烟草中的表达不但未影响植株的生长也未改变其生理生化特性。干旱胁迫处理18 d 后各株系相对质膜透性明显上升，逆境诱导型表达转基因株系R2、R3、R5的细胞质膜透性显著低于对照和S13，但与S9无显著差异（图11）。转基因株系丙二醛含量在干旱胁迫前后的变化显著低于对照，各转基因株系间无显著差异（表1和图12）。
图8 干旱胁迫对转基因株系株高的影响
Fig.8 plant height of the transgenic lines under drought stress
图9 干旱胁迫对转基因株系茎粗的影响
Fig.9 Stam diameter of the transgenic lines under drought stress
图10 干旱胁迫对转基因株系叶面积的影响
Fig.10 Leaf areas of the transgenic lines under drought stress
图11 干旱胁迫对转基因株系质膜透性的影响
Fig.11 Cell membrane permeability of the transgenic lines under drought stress
注：柱形图上不同字母表示株系间差异达到0.05的显著水平。
Note:Bars superscripted by different letters are significantly different at P＜0.05.
表2 干旱胁迫后转基因烟草株系部分性状的变化
Table 2 Changes of part of agronomic traits in transgenic lines under drought stress
注：表中数据为平均数±标准误，同一列中标以不同小写字母的值在0.05水平上差异显著（P＜0.05）叶面积指标中百分数（%）因变化值存在正、负两种数值，不便比较，故略去。
Note:The data are mean±SE，values within a column followed by different letters are significantly different at P＜0.05.The percentage of leaf areas is elided due to growth amount with both positive and negative.
图12 干旱胁迫对转基因株系丙二醛含量的影响
Fig.12 MDA content of transgenic lines under drought stress
注：柱形图上不同字母表示株系间差异达到0.05的显著水平。
Note:Bars superscripted by different letters are significantly different at P＜0.05.
3 结论
Ta6-SFT的逆境诱导型表达使转基因株系在干旱胁迫下外源基因表达增强，积累更多的果聚糖，有利于提高植物对干旱胁迫的抗耐性，具有更强的生长势。因此，推荐在转基因植物中逆境诱导型表达抗逆基因，使其发挥最大的作用，减少对转基因植物的其他不良影响。
参考文献（略）
李淑洁，李静雯：甘肃省农业科学院生物技术研究所
张正英：甘肃省农业科学院科研管理处