利用响应面法优化野生白刺茎段增殖培养基[2]
白刺，灌木，蒺藜科，是天然分布比较广泛的旱生、盐生及荒漠植物，在防止风沙危害，改良荒漠化土壤，保持沙区生态平衡中起着重要作用。另外，其果实富含多种氨基酸、微量元素和维生素，具有很大开发利用价值。然而据调查，白刺有雄性不育现象，种间杂交混乱以及种子存在高度休眠等问题，这为人工大面积栽培和良种选育带来了很大的困难，离体繁育技术则是保持白刺优良性状稳定性的重要途径之一。
关于白刺组培再生方面的研究已有不少报道，发现不同品种的白刺茎段腋芽分化增殖所需的植物生长调节剂种类差异很大，这是组培研究工作中普遍存在的问题。植物生长调节剂是植物组织培养的关键物质，虽用量极小，但在植物组织培养中起着重要和明显的调节作用，因此组培研究中，对添加植物激素的种类和浓度的研究较为普遍。我们在对甘肃荒漠野生白刺再生体系的研究中，针对这一问题，着重对白刺茎段腋芽分化增殖这一环节在单因素试验的基础上进行了响应面法优化研究。一是为今后在细胞或分子水平上研究野生白刺提供更优化的技术支持，二是为后期与锁阳实生种子接种研究提供更丰富的技术储备。
响应面分析法（RSM，Response Surface Method）采用多元二次回归的方法，将多因子试验中因子指标的相互关系用多项式近似拟合，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系。响应面分析法能够以最经济的方式对所选实验参数进行全面的分析和研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
荒漠野生白刺种子于2012年7月下旬采自巴丹吉林沙漠边缘，2013年1月温室内进行种子发芽，从发芽得到的实生苗上剪取幼嫩茎段，流动自来水冲洗30 min，放于超净工作台用75%酒精消毒30 s，再用10%次氯酸钠处理15～18 min，用无菌水冲洗4～5次，接于MS 培养基上，获得无菌试管苗。待其生长一段时间，剪取无菌试管苗幼嫩茎段，去掉基部叶片，用此单芽茎段作为试验材料进行离体腋芽分化增殖培养。
1.2 培养条件
试验基本培养基为含有3%蔗糖和0.7%琼脂的MS 培养基，附加各种激素，pH 值为5.8～6.0。组培室温度（25±2）℃，光照强度2000～3000 lx，光照时间14 h/d（如无特别说明均是以上培养环境）。所用试剂为国产化学纯药品，所用设备为植物组培实验室常用仪器。
1.3 试验方法
1.3.1 增殖诱导单因素试验
取单芽茎段接于附加有不同浓度NAA、IBA、IAA 与6-BA 组合的增殖诱导培养基中。浓度水平和组合如表1，其中设置的简化培养基为不加任何激素的MS 培养基，简写为MS0。每处理4瓶，每瓶接5株外植体，重复3次。诱导过程中，定期观察增殖情况，统计增殖系数。增殖系数=有效增殖芽数／接种茎段数。
表1 添加的外源激素浓度水平和组合（单位：mg·L-1）
Table 1 Addition of exogenous hormone concentration and combination（Unit：mg·L-1）
1.3.2 增殖诱导响应面法优化试验
采用统计软件Design-expert 8.0 进行中心组合试验（Central Composite Design，CCD）设计。根据CCD中心组合试验设计原理，在前期单因素试验结果的基础上，选取中心组合试验因子和响应值，进行响应面试验设计。每处理10 瓶，每瓶接5 株外植体，重复3 次。诱导过程中，定期观察增殖情况，统计增殖系数。
1.3.3 数据处理
单因素试验数据分析采用DPS（7.0）软件，优化试验数据分析使用Design-expert 8.0软件。
2 结果与分析
2.1 单因素试验不同激素对白刺增殖影响的结果
从结果看，不同激素对白刺试管苗茎段的腋芽分化增殖效果，在加有激素6-BA 的情况下，另加入激素IBA（0.5 mg·L-1）的6 号培养基上增殖系数达到最高值3.63，与其差异不显著的是11号培养基，增殖系数为3.24；其余激素的加入对白刺茎段腋芽增殖的效果均较之降低，差异达极显著（P＜0.01）。这里参比的简化培养基MS0的增殖效果仅低于6 号和11号，却显著高于其他激素。而且，只有在这3种培养基中，茎段芽苗的增殖生长状态是健康的（表2）。
表2 不同激素对白刺增殖影响的结果
Table 2 Results of different hormone on the proliferation of Nitraria sibirica(https://www.daowen.com)
2.2 响应面优化试验的方案与分析结果
在单因素诱导试验的基础上，6-BA 和IBA 配合使用对增殖效果最好。根据CCD 中心组合试验设计原理，采用6-BA 和IBA 2 因素5 水平的响应面分析方法，以第6 个配方浓度为中心参考，试验设计所得各水平分别为：6-BA，0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.35 mg·L-1、0.4 mg·L-1；IBA，0.1 mg·L-1、0.22 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.8 mg·L-1、0.92 mg·L-1。
2.2.1 模型的建立与显著性检验
对6-BA 浓度X1、IBA 浓度X2做如下变换，以增殖系数作为响应值Y：xi＝（Xi-X0）／X；式中：xi为自变量的编码值；Xi为自变量的真实值；X0为试验中心点处自变量的真实值；X 为自变量的变化步长。共13 个试验点，试验号1～8 是析因试验，9～13 是中心试验，零点试验重复5次，以估计试验误差。试验设计方案与试验结果见表3。
表3 中心组合试验设计与结果
Table3 Central composite design and its experiment result
所得数据经Design-expert 8.0 软件进行回归分析，以芽增殖系数为响应值，经回归拟合后，得到最终的回归预测方程：y＝-1.95145+19.95830x1+13.31227x2+2.89655x1·x2-48.67200x12-12.72889x22。式中：y 为增殖系数；x1为6-BA 浓度，mg·L-1；x2为IBA 浓度，mg·L-1。回归方程的失拟检验P=0.3799＞0.05，差异不显著；总回归方程F 检验P＝0.0001＜0.01，差异达到极显著。方程一次项的影响中，x1的P=0.4015＞0.05（差异不显著），x2的P=0.0033＜0.01（差异极显著）；二次项x12和x22的P 值均＜0.0001（差异极显著）；两因素间的交互作用x1·x2的P=0.2933＞0.05（差异不显著），校正决定系数R2＝0.9648，表明96.48%的试验数据可用此模型解释。由此可以看出，该回归方程对试验拟合情况好，可以很好地描述各因素与响应值之间的真实关系。IBA（x2）对白刺增殖的影响最大。
2.2.2 响应曲面分析
根据拟合方程，绘制两因素对白刺茎段腋芽分化增殖系数的响应面和等高线图（图1）。响应曲面图形是特定的响应值y对应自变量构成的一个三维空间图。从响应面图上可清晰地看出最佳参数及各参数之间的相互作用关系。当特征值为正值时响应面分析图为山丘形曲面，可以得到极大值；当所有特征值为负值时则为山谷曲面，有极小值存在；当特征值有正有负时为马鞍形曲面，无极值存在。由图1中响应曲面图可较为直观地看出，6-BA 和IBA 存在极点值。两因素对白刺增殖系数的影响：IBA 对增殖系数的影响较为显著，表现为曲线较陡；6-BA 对增殖系数的影响不显著，表现为曲线较平缓。再从等高线图1可以看出存在极值的条件在圆心处，等高线形成的图形也显示了两因素交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。图1中等高线表现为接近圆形，表明6-BA、IBA两因素交互作用较小。
图1 y=f（x1，x2）响应曲面图及其等高线
Fig.1 Response curved surface figure and its equal-height line of y=f（x1，x2）
2.2.3 最佳配方的验证
由以上试验回归模型预测的白刺茎段腋芽分化增殖最佳培养基配方为：IBA 浓度为0.55 mg·L-1，6-BA浓度为0.22 mg·L-1。用所得最佳值进行响应面法所得结果的可靠性验证试验，每次10瓶，重复3次。统计增殖系数，实际得到的增殖系数为3.90，为理论预测值的99.82%，与理论预测值基本吻合，因此，采用中心组合试验设计优化得到的最佳腋芽分化增殖配方准确可靠，具有实用价值。
3 讨论与结论
从增殖诱导的前期单因素试验结果看，在加有激素6-BA（0.2 mg·L-1）+IBA（0.5 mg·L-1）、IBA（0.5 mg·L-1）的培养基上增殖效果均较好。另外，在简化MS0培养基上也有有效的增殖生长，这一结论与之前何正伦、张红晓等的研究结果不同，可能与所采用的实生苗茎段较外界生长的枝条茎段幼嫩有关，其分生能力强，在MS0培养基上能够直接生根、拔节生长。这使得在MS0培养基上增殖生长，成为一种可取的简化增殖方式，避免了复杂的激素组合配比试验，为今后不同品种的白刺进行初步再生体系的建立提供了参考。
从响应面分析法试验结果看，优化出的野生白刺茎段腋芽分化增殖诱导最佳培养基为：MS+6-BA（0.22 mg·L-1）+IBA（0.55 mg·L-1）。优化后的培养基增殖系数从之前单因素试验所得最高增殖系数3.63提高到了3.90，为野生白刺组培后续研究奠定了基础。
本文中应用的响应曲面分析法相对于传统的统计方法，是一种试验次数少，回归方程精度高，能研究多种因素间交互作用的回归分析方法，能反映出各因素连续变化趋势以及各因素相互作用下的理论最佳工作条件，求得的各参数组合更加精确，可以大大降低生产实践过程中造成的原料浪费，是一种经济、高效、实用的试验方法。
参考文献（略）
张艳萍：甘肃省农业科学院生物技术研究所
赵玮：甘肃省农业科学院作物研究所
董治宝，罗万银：中国科学院寒区旱区环境与工程研究所沙漠与沙漠化重点实验室