重组体构建、筛选与鉴定
无论化学合成还是PCR扩增获得的目的基因要想导入宿主细胞克隆，进行后续功能的研究，必须与载体片段进行重组体构建。目前，目的片段与载体连接主要有几个途径，一条途径是T 载体连接，另一条途径是酶切连接重组，还有一条途径是应用Gateway 技术进行重组。
利用Taq 聚合酶扩增目的基因往往会在每条链的3′端加上一个突出的碱基A，或者扩增后加上A 碱基。T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3′端带有一个突出的T碱基，在连接酶的作用下，就可以通过AT 配对形成含有目的片段的克隆重组体。构建到T 载体上的目的基因经鉴定后，为了后续功能研究，一般要通过酶切连接构建到表达载体上。
用于基因克隆的载体具有一段集中存在的单一限制性酶切位点，可以供目的基因插入使用。而目的基因在获得的同时，一般人为地在基因序列两端也加入了相对应的酶切位点，利用相应的限制性内切酶，可以把环形质粒和目的基因切成带有相同黏性末端或平末端的DNA 片段。酶切产物经纯化回收获得目的片段，在连接酶的作用下，对应的末端会通过碱基配对形成重组体。酶切连接重组过程中，若载体和目的基因使用的是一种相同的限制性内切酶，就是一种单酶切的连接方式，在连接的重组体中，目的基因有正向连接和反向连接两种插入方式；如果载体和质粒都是采用两种相同的限制性内切酶切割（不全产生平末端），则目的基因酶切片段的两端就会分别与载体酶切末端互补连接，目的基因只能以一种特定的方向插入载体分子。在酶切连接重组前，就要根据载体的多克隆位点序列设计目的基因序列两端的酶切位点，且一定要避免目的基因内部不能存在相同的酶切位点。
Gateway 重组技术是在离体条件下产生重组DNA 分子的新方法，其基础是在重组酶λ整合酶催化的位点特异性重组反应，该方法具有位点特异性特征。在构建过程中，可以不依赖限制性内切酶，在重组酶的作用下可以高效、快速地将目的基因克隆到载体的特定重组位点。整个方法由LR 和BP 两个反应组成，LR 反应是将目的基因构建到入门载体上，BP反应是将目的基因进一步转移到目的载体上。
通过上述方法获得的重组体，虽然具备复制或表达的潜力，但它们必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所用载体的性质，将重组体导入受体可用不同的方法。一种是转化，它是以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。采用CaCl2转化法转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态，即容易接受外源DNA 的状态，然后再利用短暂热休克使DNA 导入细菌宿主中。此外还可以用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。利用噬菌体DNA 作为载体时可通过转染和感染两种方式导入受体菌。感染，即在体外将噬菌体DNA 包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。转染，即在DNA 连接酶的作用下使噬菌体DNA 环化，再像重组质粒一样地转化进受体菌。习惯上常把以噬菌体DNA 为载体构建成的重组体导入细胞的过程统称为转染。
目的基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组体的菌落，并鉴定重组体的正确性。通过细菌培养以及重组体的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝，并通过进一步鉴定，最终确定其正确性，为进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物奠定基础。
重组体的筛选与鉴定主要有以下方法：
1.抗药性标志的筛选
如果载体带有某种抗药性标志基因如ampr 或kanr，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA 时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。
2.β-半乳糖苷酶系统筛选
很多载体都携带一段细菌的lacZ 基因，它编码β-半乳糖苷酶N-端的146 个氨基酸，称为α-肽，载体转化的宿主细胞为lacZΔ15 基因型，它表达β-半乳糖苷酶的C-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β-半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为蓝色化合物，这就是所谓的α-互补，而重组子由于基因插入使α-肽基因失活，不能形成α-互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。(https://www.daowen.com)
3.菌落快速裂解鉴定法
从平板上挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。
4.内切酶图谱鉴定
经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片段；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。
5.通过聚合酶链反应筛选重组子
一些载体的外源DNA 插入位点两侧存在特定的序列，如启动子序列等，利用这些特异性序列作为引物，对小量制备的质粒DNA进行聚合酶链反应（PCR）分析，不但可以迅速扩增插入片段，判断其是否是阳性重组子，还可以直接对插入片段进行DNA序列分析。
6.菌落或噬菌斑原位杂交
先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后用标记的特异DNA 探针进行分子杂交，挑选阳性菌落，该法能进行大规模操作，一次可筛选多达5×105～5×106个菌落或噬菌斑，特别适于从基因文库中挑选目的基因。
7.测序鉴定
初筛鉴定有重组子的菌落，经小量培养后分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用基因测序仪对目的基因部分进行序列测定，测序后与目的基因序列比对鉴定其正确性。