三、其他方法
1.孤雌生殖诱导系法（玉米）
诱导系品种间杂交指用该系作为亲本，与选系用的基础材料进行杂交，杂交后在当代杂交果穗上就可以产生一定比例的单倍体籽粒。这种方法在玉米单倍体育种中应用较为成功。玉米诱导系杂交法中单倍体的诱导受细胞核基因控制，并且可以稳定遗传性状；但该方法诱导除产生单倍体外，还会出现大量的二倍体，且单倍体的产生不符合孟德尔遗传分离定律，研究起来颇为复杂，因此对于其遗传及分子机理尚未完全研究清楚。
选育综合性状优良的高频诱导系是进行玉米单倍体育种的先决条件。Stock6是最早在玉米单倍体技术中应用的诱导系，杂交后代中能够产生平均约2%的孤雌生殖的单倍体，该方法通常无基因型依赖性、诱导过程简单，因此是大量生产玉米单倍体的有效途径，但其主要缺点是其植株生长矮小、散粉少、对温度敏感、结实性较差、标记基因弱。因此，从20 世纪50 年代以来，诸多育种工作者致力于单倍体诱导系的选育，并结合各个特定的区域生态环境，经过不懈努力，国内外已培育出了大量优良的诱导系和诱导系间杂交种，部分诱导系的诱导率达到了8%以上（表5-4），这为该技术日益成熟和完善奠定了坚实的基础。
表5-4 目前国内外主要的玉米单倍体诱导系
才卓等人（2013）在多年研究及实践验证的基础上，制定了《玉米杂交诱导单倍体选育自交系技术规范》，利用该规范程序，只需2～3个生育世代即可批量选育出高度纯合的玉米自交系（加倍单倍体系）。现将该技术要点概述如下：
（1）杂交诱导
首先将基础材料与诱导系的株数按6∶1 进行播种，要尽量选用花期与基础材料相近的诱导系，采取分期播种（2～3 期）、地膜覆盖加快早熟或延期管理促晚熟等系列措施，以确保花期能够相遇，使杂交顺利完成。杂交授粉时以单倍体诱导系作为父本，被诱导的母本基础材料作为母本，授粉时间、方式与普通杂交相同。但花丝的长短与授粉时间对单倍体诱导率有重要影响，一般在凉爽季节授粉或延迟授粉（长花丝≥8 cm）时有利于提高单倍体诱导率（提高1.5～2 倍），但结实率会有所下降。杂交果穗成熟后及时收获并妥善保管，通常所收获的籽粒中含有一定比例的无胚种子和不发育空壳籽粒；籽粒干燥后脱粒，尽量避免籽粒受到机械损伤。
（2）单倍体籽粒的鉴选
通过色素基因在诱导的杂交籽粒上表达色素，肉眼就可以方便直观地对单倍体进行选择。在玉米单倍体诱导中，利用玉米籽粒的R-nj 基因（Navajo 标记）和ABPl 基因（紫色叶鞘标记）是最基本的方法，可根据籽粒顶部和胚芽颜色对单倍体做出初步判断，一般情况下杂交籽粒胚乳糊粉层为紫色及胚芽无色的为单倍体籽粒，胚乳糊粉层及胚芽均为紫色或无色的为二倍体籽粒。在杂交果穗数量较为充足时，可去掉果穗的上下端的圆形籽粒，将中部扁形籽粒进行混合脱粒后进行单倍体籽粒鉴定。因着色程度由多个修饰基因所控制（C1-I、Idf等）以及发育环境等因素的影响，在硬粒型品种及热带材料中Navajo 标记表现较弱，着色不清楚，需要加大预留比例，并要靠经验判断；这些籽粒也可继续在田间种植，根据植株的ABPl 紫色标记做进一步判断，即凡幼苗叶鞘绿色的为单倍体，而紫色的为杂交二倍体。此外，如果以农大高诱1号或其衍生系作为诱导系时，除可利用上述方法鉴定单倍体籽粒外，亦可以根据籽粒的含油量通过改良的核磁共振仪（NMR）进行单粒油分含量的测定，进而实现机械化自动选择；以基础材料自交籽粒的含油量为标准，高于自交籽粒的为双受精籽粒，而显著低于自交籽粒的可认为是单倍体籽粒。
（3）单倍体植株的确认
玉米诱导单倍体的自然加倍率一般在10%左右，但不同材料的加倍率也有较大差异。在凉爽和温和的生态环境种植诱导的玉米单倍体籽粒，有利于植株的自然加倍，如冬季在海南种植的加倍率明显高于北方春季播种的。种植单倍体籽粒时，需选择土壤肥力中上及排灌方便的地块，并在最适播期播种，以确保全生育期有优良的生长发育环境和肥水保障。单倍体植株由于生长缓慢发育弱，加倍过程更需要良好的环境和条件。
幼苗10 叶期前后，可根据植株ABPl 紫色标记及形态学特征对单倍体进行鉴别，凡幼苗叶鞘及叶片为紫色且植株粗大高壮的均不是单倍体，予以淘汰。但需要注意紫色标记性状可能会因自然突变而丧失，因此还需依据幼苗其他特征来判断，如生长发育速度、叶色、叶长以及株高等。一般单倍体植株瘦弱，生长缓慢，株高低，叶片相对数量较少、狭窄或直立，偶尔会有白斑，叶片短且较上冲，叶色浅，叶鞘绿色。(https://www.daowen.com)
（4）单倍体植株的加倍
一般约80%的单倍体植株的雌穗自然可育，而雄穗的自然加倍率仅为5%～10%，且不同基因型材料间存在较大差异。对于散粉株率高的单倍体材料，依靠育性的自然恢复即可实现自交结实。当单倍体植株的花药外露且有花粉明显产生时，小心取其花药，破开后取其花粉，进行精细自交授粉操作；次日有花粉时，重复一次自交授粉；授粉后严格封闭套袋。
对于自发加倍率低的材料，可对其进行人工加倍。加倍化学试剂一般为秋水仙素，同时配合二甲基亚砜和细胞分裂素等助渗剂使用效果较好。加倍方法主要有浸种法、浸根法、浸芽法和注射法等。浸种法是先将所获得的单倍体籽粒用清水浸泡12 h，之后用秋水仙素溶液（0.6 mg/mL）浸泡24 h，清水浸泡6 h 后播种。浸芽法为用秋水仙素溶液浸泡幼芽的方法，即当单倍体籽粒萌发形成的芽长至2～3 cm时，用秋水仙素溶液（0.06～0.2 mg/mL）分别浸泡根或芽18 h 和12 h，之后用清水浸泡6 h，加倍成功率可达到18%以上。浸根法是将3 叶期的单倍体幼苗的根系在秋水仙素溶液（0.05%或0.15%）中浸泡24 h 或3 h，清水冲洗处理后进行移栽；该方法加倍效果好，雄花可育率能达到30%～60%，但所需剂量较大，成本较高。注射法是在6叶期时，用注射器将秋水仙素溶液（0.4%～0.6%）与二甲基亚砜（DMSO，2.0%）配成的混合溶液2.0 μL 注射到植株茎尖生长点，其加倍率可达32.3%；该方法一般在精密试验时采用，优点是不需进行育苗和移栽，难点在于处理时期和注射部位的选择比较难以把握，从而影响加倍的效果。
（5）加倍单倍体的收获及保存
果穗成熟后或授粉后35 d左右时仔细收获其果穗，避免自交籽粒丢失。干燥后小心脱粒并妥善保管，尽量避免自交籽粒受到损害。
（6）加倍单倍体植株的获得、鉴定及繁殖
选择肥水条件良好的地块播种，播种时按单穗分行仔细播种，确保出苗正常，勿受病虫危害。同一果穗的多个加倍单倍体籽粒在播种后如植株长势整齐一致、籽粒无分离，且不是杂交种株型时可确认为是纯合加倍单倍体自交系；对于一些来源于同一果穗但在播种后得到的果穗严重分离，或带有诱导系标记性状，则可能为杂合花粉污染或加倍单倍体系中含有诱导系的DNA 污染所致，应及时淘汰。对于单株的加倍单倍体植株，如长势良好且符合自交系性状特征，应先自交，根据其生长势、植株形态和籽粒颜色等统筹予以收获；第2年按穗行播种繁殖，获得的植株长势整齐一致，即可确认为纯合的玉米加倍单倍体自交系。
将确认为纯合自交系的加倍单倍体植株仔细自交授粉，获得自交籽粒，第2年通过相应环节的鉴定，选出表现优异的加倍单倍体系，第3年即可作为新的自交系进行配合力测定和杂交组合的配制等。
2.未受精子房/胚珠培养
在子房或胚珠培养过程中，雌配子体（一般指未受精的卵细胞）受刺激启动雌核发育途径，进而产生单倍体再生植株。这种方法的研究与利用的程度远不及花药与小孢子培养，但在黄瓜、甜瓜等葫芦科植物的单倍体诱导中得到广泛使用；同时在雄性不育系或雄性配子诱导反应较差的基因型的单倍体生产中具有独特的优势。目前在葫芦科、禾本科、菊科等14科的30多个植物中通过该方法获得了单倍体再生植株（表5-5）。
影响植物离体雌核发育成效的因素主要有供体植株的基因型、接种胚囊的发育时期、预处理方式、培养基类型及组成、培养条件等。基因型是其中最重要的影响因子（Mukhambetzhanov，1997），一般认为杂合子比定型品种的诱导率高，粳稻比籼稻的诱导率高。研究发现，玉米的成熟子房较幼嫩子房更易于诱导单倍体产生，烟草从大孢子母细胞至成熟胚囊期均可诱导单倍体植株；培养基则一般使用改良的MS、N6、Miller等作为基本培养基。
表5-5 子房和胚珠培养获得单倍体再生植株的植物
