基于分子杂交技术的分子标记
基于分子杂交技术的分子标记主要包括RFLP 标记（Restriction fragement length polymorphisms，限制性片段长度多态性，简称RFLP 标记）、VNTR 标记（Variable number of tandemrepeats，可变数目串联重复序列，简称VNTR 标记）和原位杂交（in situ hybridization）等。RFLP 标记是出现最早的DNA 标记技术，于1980 年由人类遗传学家Bostein提出。
1.RFLP标记的原理
RFLP 的基本原理是特定生物类型的基因组DNA 经限制性内切酶消化后，产生数百万条DNA 片段，通过琼脂糖电泳将这些片段按大小顺序分离开来，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素（如32P）或非放射性物质（如生物素、地高辛等）标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交（Southeern 杂交），若某一位置上的DNA 酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合于这个位置上，后经放射自显影或酶学检测，即可显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性的情况。RFLP 的产生主要是由于植物基因组DNA 序列上的变化，如碱基替换造成某种限制性内切酶（restriction enzymes，简称RE）酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段的插入、缺失或重复等。对每一个DNA/RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。
RFLP 是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）DNA 水平的差异（多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针来源于同种或不同种基因组DNA 的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记（Mark），构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA 后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ、amHⅠ、EcoRⅠ、EcoRV、XbaⅠ，而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。因此构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。
2.RFLP标记的基本类型
（1）点的多态性
表现为DNA 链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交即可诊断。
（2）序列多态性
因DNA 链内发生较大部分的缺失、重复、插入等变异，其结果是即使其内切酶位点碱基序列没有变化，但原有的内切酶位点相对位置发生了变化，从而导致RFLP的发生。
3.RFLP标记的方法步骤（见图6-1）
图6-1 RFLP标记技术分析流程图
（1）基因组DNA的酶解
①大片段、高纯度DNA 的提取详见植物基因组DNA 提取实验，要求提取的DNA 相对分子质量大于50 kb，没有降解。
②在50 μL 反应体系中，进行酶切反应体系中包含5 μg 基因组DNA，5 μL 10×酶切缓冲液，20 U限制酶（任意一种），加dd H2O至50 μL。
③轻微振荡，离心，37 ℃反应过夜。
④取5 μL 反应液，0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30 kb 的明显亮带出现。
（2）Southern印迹转移
①酶解的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳（可18 V 过夜）后EB染色观察。
②将凝胶块浸没于0.25 mol/L HCl中脱嘌呤，10 min。
③取出胶块，蒸馏水漂洗，转至变性液变性45 min。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30 min。
④预先将尼龙膜、滤纸浸入水中，再浸入10×SSC中，将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸（桥），然后将胶块反转放置，盖上尼龙膜，上覆两层滤纸，再加盖吸水纸，压上500 g重物，以10×SSC盐溶液吸印，维持18～24 h。也可用电转移或真空转移。
⑤取下尼龙膜，0.4 mol/L NaOH 30 s，迅速转至0.2 mol/LTris·Cl、2×SSC（pH7.5）溶液中5 min。
⑥将膜夹于两层滤纸内，80 ℃真空干燥2 h。
（3）探针标记
将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α-32P）或非放射性元素（如Dig-dUTP等）标记，经纯化后再用。
①取1.5 mL 离心管于冰上，将1 μg DNA 和19 μL dd H2O 混匀，短暂离心至管底，放至100 ℃水浴中变性10 min，之后迅速置于冰浴上5 min。(https://www.daowen.com)
②地高辛标记：按反应体系在变性DNA中依次加入2 μL六聚核苷酸混合物，2 μL dNTP标记用混合物，1 μL Klenow 聚合酶。37 ℃保温1～20 h，加入2μL EDTA（0.2 mol/L），终止反应，加2μL 4 mol/L LiCl，75 μL预冷的乙醇沉淀DNA，-70 ℃30 min或-20 ℃2 h，离心收集沉淀物，真空干燥后加50 μL TE溶解。
③同位素标记：按反应体系在变性DNA 中依次加入2 μL dNTP、3 μL dNTP 随机引物，1 μL Klenow 聚合酶。在同位素操作台上，加入1 μL32P 标记的d NCP（a-32P d CTP，放射性比活＞300 ℃/mmol），30 ℃温育3 h以上。
（4）杂交
①预杂交：将酶解的DNA 转移膜放入杂交袋内，取适量经65 ℃预热的Hyb 高效杂交液（Hyb-100），加入杂交袋中排尽气泡，65 ℃杂交炉中预杂交2 h（8～15 r/min）（杂交液的用量一般为1 mL高效杂交液/10 cm2胶）。
②探针变性：将已标记好的探针在沸水浴中变性10 min，立即放冰水浴冷却10 min（探针一经变性，立即使用）。
③杂交：排尽预杂交液，在适量高效杂交液（Hyb-100）中加入3.0 μL 新变性好的探针（1～3 μL/膜，5～20 ng/mL杂交液），混匀，65 ℃杂交仪中杂交过夜（8～15 r/min）。
④杂交完成后，将杂交液回收置于耐低温又可耐沸水浴的管中，贮存于-70 ℃以备重复使用。重复使用时，解冻并在65 ℃下变性10 min。
（5）洗膜、信号检测（化学显色法）
①杂交后室温下，20 mL 2×SSC，0.1%SDS 洗膜5 min×2次。
②50 ℃，20 mL 0.1×SSC，0.1%SDS 洗涤15 min×2次。（洗液需要先预热到50 ℃）
③再将膜置于20 mL 洗涤缓冲液中平衡2～5 min。
④将膜在10 mL阻断液中阻断30 min（在摇床上轻轻摇动）。
⑤封闭完成后倒出阻断液，加入稀释好的10 mL 抗体溶液，浸膜至少30 min。［Anti-Dig-AP 在10000 r/min离心5 min。离心后将Anti-Dig-AP 用阻断液稀释（1∶5000），2.0 μL Anti-Dig-AP 加入10 mL封闭液混匀］
⑥去除抗体溶液，用20 mL 洗涤缓冲液缓慢洗膜2 次，每次15 min。
⑦去除洗涤缓冲液，在20 mL 检测液中平衡膜2 次，每次2 min。
⑧用检测缓冲液稀释300 μL NBT/BCIP 化学显色底物，在约15 mL 新鲜制备的显色液中反应显色，在显色过程中勿摇动。
注意：在几分钟内即有颜色开始沉淀，并在16 h后完成反应。为检测显色程度，膜可以短时间暴露于光线下。
⑨当达到所需的点或带强度后，用50 mL双蒸水或TE 缓冲液洗涤5 min 终止反应，照相记录结果。
（6）放射自显影（同位素法）
①洗膜：室温下用20 mL 2×SSC，0.1%（W/V）SDS洗膜，5 min×2次；68 ℃用20 mL 0.1×SSC，0.1%（W/V）SDS洗膜，15 min×2次。
②包膜：膜从洗膜液中捞出，在滤纸上晾干，膜表面无可见水膜为止（注意：不能太干，以防探针难以洗脱影响再次使用），用保鲜膜包膜，压X-光片，置于-20或-70 ℃3～7 d（依据信号强弱掌握曝光时间）。
③在暗室红灯下取出X-光片，置入显影液中至杂交带显现出来（显影时间依据信号强弱及曝光时间长短可由几秒钟到2 min），转入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮（约10 min）。自来水冲洗干净后，晾干，读片。
4.RFLP标记试验操作中特别需要注意的问题
（1）作为检测对象的DNA 分子必须保持大分子，在抽提DNA 的过程中一定要避免由于操作不当等原因将DNA分子打断成小片段的DNA，否则最终显示的RFLP图谱可能是一种假象。
（2）在用限制性内切酶消化大分子DNA 时，DNA 浓度不能太高，要使DNA 被完全消化（电泳条带呈弥散状），否则所得的结果也不可靠；有时用一种限制性内切酶不能充分消化大分子DNA时，应换一种消化效果更好的消化酶。
（3）电泳时要用低压电泳，转膜时绝对防止胶与膜之间有气泡发生，加盖过滤时也不应有气泡发生。
（4）杂交前探针必须充分变性；要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA 间序列互补的程度和G、C的含量来掌握杂交和洗膜的条件。
（5）放射自显影时，要根据杂交后膜上的放射活性等因素决定曝光的时间。
5.RFLP技术的优点
（1）无表型效应。RFLP 不受发育阶段或器官特异性的限制，也不受环境条件及基因互作的影响，它揭示的是DNA水平自然变异，其标记的数目几乎是无限的。
（2）RFLP 标记具有共显性的特点，因而配制杂交组合时不受杂交方式的影响。所谓显性标记指的是F1的多态性片段与亲本之一完全一样，而共显性标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。因此，基于RFLP 标记的共显性特点已被广泛用于多种生物的分析中，特别是成功地构建植物遗传图谱。
（3）RFLP 具有高度变异性，每一植株都会有大量的多态性。通常通过有性杂交建一个作图群体，就能构建一个较丰富的RFLP图谱。
（4）RFLP 标记范围遍及全基因组，因而它已被广泛用于有益基因的分子标记定位，数量性状微效基因的质量化以及用于杂种优势的理论探讨和有效预测。
6.RFLP标记的不足
（1）RFLP技术对样品纯度要求较高，样品用量大（DNA量为5～15 μg）。
（2）RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量。
（3）检测中要利用放射性同位素（通常为32P），易造成环境污染。虽然也可以用非放射性物质（如Biotin 系统、Dig 系统等）替代同位素，但其杂交信号相对较弱，灵敏度较同位素标记低得多且价格较高。
（4）检测步骤烦琐，需要的仪器、设备较多，工作量大，周期长，成本高昂，其应用受到了一定的限制。
总之，RFLP 标记很难直接用于育种，将RFLP 标记转化为PCR 标记，便于在育种上利用。