三、影响因素
1.基因型、转化路径及方法
任何转化方法，在保证外源DNA 有效进入受体的同时也要确保材料受到尽可能小的伤害，以防止其后期的生长发育受到阻碍。因为植物的花朵、花柱、子房、种胚、胚芽等器官，组织的大小及形状各有不同，所以根据受体材料组织构造及生理特性选择合适的外源基因导入方式十分重要。例如，玉米和棉花根据其花器结构可以采用子房注射，但诸如水稻这类小花作物则以滴注的方法为宜。另外，导入时间的选择也至关重要。周光宇提出，棉花开花后花粉管达到子房需要8 h，花粉管通道形成需要20 h，之后4 h内花柱外缘至子房部位会形成栓塞结构，影响DNA进入子房。林栖凤（2004）认为，由于番茄需50 h才能完成其受精过程，因此导入时间应选择在其盛花期10～20 h以后。李琼（2012）在对新疆海岛棉原位转化研究中使用过两种方法。一种是蘸花法，于棉花盛花期开花前2 h，对准花柱柱头及时进行菌液喷洒并标记挂牌；另一种是花粉管通道法，在棉花开花后20～28 h 内用微量注射器将质粒注射入棉花子房中，经花粉管通道进入胚珠转化受精卵细胞。结果表明，两种方法均可获得转基因植株，农杆菌菌液喷雾法较花粉管通道法转化率高3.4%，T0 代成铃率也高8.3%。植物受精所需的时间除具有属或种的特异性和植物基因型的特点外，还受传粉方式、温度、湿度等环境因素的影响。
刘宁（1998）在研究中发现，甘蓝型油菜花柱类型为空心花柱，柱头表面结构粗糙，在花柱的中央有一至数条纵行的沟，柱头内部细胞组织疏松，这样的结构有利于农杆菌的吸附和迁移；而白菜花柱属于实心型花柱，花柱的中央分化出引导组织，花粉管沿引导组织的胞间隙生长，这种结构则可能不利于农杆菌到达胚珠，进而影响转化效率。Rkauosk等（1997）对农杆菌渗透处理后的拟南芥研究发现，即便是处理后3～6 d的植株，植物组织中的农杆菌数量仍可以达到1.2×108个/g。这说明农杆菌能够在处理后的拟南芥植株表面和内部存活很长一段时间，拟南芥拥有适于农杆菌存活的内部环境。可见，农杆菌在植株体内的长期生存有利于遗传转化。而韩笑（2012）研究表明，白菜植株中农杆菌的活力受到严重抑制，涂板后3 d 内未出现大小正常的菌落。可能白菜植株体内的微环境对农杆菌的存活是不利的。相似的情况也见于徐恒戬（2004）的报道中，无论在花、茎还是叶片中，CFU 数量随植株处理后恢复时间的延长迅速减少。刘明（2011）在对大豆的原位转化中发现，两种花柱切割处理后报告基因质粒载体转化大豆，均获得了转基因大豆植株。切割1/3 花柱，获得2 株阳性植株，转化率为1.6%，而贴近子房切割处理，获得4 株阳性植株，转化率为3.1%，两种转化路径的转化率差异显著。总之，分子育种的具体操作细节，必须根据不同作物特点具体制定，并通过实践不断地加以完善。
2.菌株类型、菌液或目的DNA浓度及其侵染共培养时间
农杆菌的侵染能力受植物类型、菌株及载体类型等因素的影响。不同类型的菌株CHV基因决定了其对受体细胞的识别和附着能力的差异。根癌农杆菌的胭脂碱型和琥珀碱型生长快、不结球、转化易于操作，但共培养时菌体附着能力较差；章鱼碱型则生长慢、易结球、转化难于操作，但共培养时菌体附着后不易洗去。陈仲等（2014）的研究表明，影响杨树遗传转化效率的主要因素是农杆菌菌株和杨树基因型，此外，培养基pH 值、菌液浓度、预培养时间和光照强度等因素也影响其转化效率。
农杆菌适宜的侵染浓度和时间因外植体对侵染的敏感性不同而有很大差异。浓度过高、时间过长会引起农杆菌细胞间的竞争性抑制，而且过度增殖会抑制受体细胞的呼吸作用，浓度过低、时间过短则造成受体细胞表面农杆菌附着不足。禾谷类作物一般侵染浓度较高，Hiei（1997）用LBA4404（pTOK233）转化水稻的最佳接种浓度OD600为0.8～1.0，但烟草、大白菜等对侵染敏感的双子叶植物要求菌体浓度要低得多，一般OD600为0.5。DNA 浓度太高，过于黏稠，会影响DNA 渗入子房的速度，或因DNA 量过大，影响子房的发育。转化用的DNA 要达到一定纯度，提取过程应尽量除去酚类有害杂质，以免对子房产生毒害作用而影响转化效果。
侵染后共培养时间也至关重要。烟草等对农杆菌侵染比较敏感的植物的共培养时间一般较短，液体细菌培养基介质应用较多。许多单子叶植物等不敏感植物受体与农杆菌共培养时间一般较长，用细菌培养介质容易造成农杆菌过度繁殖，导致植物外植体呼吸作用抑制和细菌分泌物毒害，因此多采用液体植物培养基作为共培养介质。众多研究表明，2～3 d 作为受体材料与农杆菌共培养的时间较为适宜。时间过短，T-DNA 转移过程不能完成；时间过长，农杆菌在培养基及受体材料表面会过分生长，不利于植物外植体的存活。(https://www.daowen.com)
3.诱导物质
酚类是vir 区基因表达的主要信号物质。酚类物质产量浓度被认为是影响农杆菌转化特别是单子叶植物转化的主要原因之一。在众多的酚类物质中，乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮诱导能力较强，AS 的促进效果与菌株类型、植物材料种类和共培养培养基的pH 值有关。AS难溶于水，根据侵染受体的不同选择不同溶剂。一般用于拟南芥花侵染的，使用DMSO 作为溶剂，用于愈伤组织侵染的，则用少量甲醇溶解后再用蒸馏水定容。AS的贮存液需过滤灭菌，并且在培养基温度小于60 ℃时加入。在众多研究中，AS的有效使用浓度一般在50～200 μmol/L。Mohri 等（1997）在日本白桦的转化中报道，加入AS 100 μmol/L 可使转化率提高8 倍。张天宇等（2007）在苜蓿转化过程中向农杆菌液体培养基及共培养基中都加入10 mg/L的AS时，GUS阳性率、抗性愈伤率和抗性芽再生率均高于其他处理，但当AS浓度大于20 mg/L时则抑制转化。
蔗糖用于提高培养基渗透压，使植物细胞发生一定的质壁分离，促进农杆菌与植物伤口的接触，对农杆菌介导的遗传转化有着很好的辅助作用。糖类等小分子，一方面可作为化学源吸引农杆菌的趋化运动，另一方面可诱导或抑制农杆菌vir 基因的表达，同时为农杆菌的生长提供碳源，有利于农杆菌在受体表面的吸附和生存。特别是在AS 浓度很低的情况下，它们可强烈诱导vir基因的表达，并且与AS存在协同效应，可显著提高AS诱导效果。糖类在不含酚类化合物的情况下效果较明显，但是糖类和酚类化合物同时存在时却没有明显的协同效应。
菌液中添加表面活性剂对提高遗传转化率产生显著的正向效应。1998 年Clough 等对真空渗透遗传转化技术做了进一步改进和优化，在农杆菌悬浮液中加入蔗糖溶液与Silwet L-77，并取代了真空渗透处理，结果表明加入5%的蔗糖和0.02%Silwet L-77可以达到更理想的转化效果。Curtis 和Hong（2001）采用浸花法在对萝卜进行转化中发现研究者选取三种农杆菌浸染液中的表面活性剂进行对比，结果表明在Pluronie F-68、Tween 20 及Silwet L-77中，Silwet L-77的效果是最好的。
4.超声波辅助
农杆菌介导法具有宿主特异性，而且农杆菌不能进入植物组织内部，而超声波辅助的遗传转化可以消除这些障碍。1997 年，Trick 和Finer（1997）第一次报道了超声波辅助的农杆菌遗传转化法。经超声波处理，植物组织表面和内部会出现很多微伤口，增加了农杆菌与外植体的接触范围，有利于农杆菌进入植物组织内部。